DB3707T 133-2024 西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程_第1頁
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文檔簡介

ICS65.020.20CCSB16

3707濰 坊 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB3707/T133—2024西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程Technicalcodeofpracticeforidentificationofwatermelonfusariumwiltpathogen2024-12-19發(fā)布 2025-01-20實施濰坊市市場監(jiān)督管理局??發(fā)布DB3707/T133DB3707/T133—2024DB3707/T133DB3707/T133—2024IIIIII目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1鑒定程序 1田間取樣 2癥狀檢查 2病原菌的鑒定 3過程記錄及檔案保存 4附錄A(資料性)西瓜枯萎病危害癥狀 5附錄B(資料性)馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)配制方法 6附錄C(規(guī)范性)西瓜枯萎病菌致病性測定 7附錄D(資料性)西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征 8附錄E(資料性)西瓜枯萎病菌DNA的提取 9附錄F(資料性)西瓜枯萎病菌PCR檢測 10參考文獻 11前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由濰坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出、歸口并組織實施。本文件起草單位:優(yōu)奈爾生物科技有限公司、濰坊郭牌農(nóng)業(yè)科技有限公司、濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。楊珊、辛國鳳、楊琪、邢石磊。DB3707/T133DB3707/T133—2024DB3707/T133DB3707/T133—2024PAGEPAGE11PAGEPAGE10西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于西瓜枯萎病菌的檢測和鑒定。規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義SN/T2589-2010界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。癥狀 symptom2589—2010,定義3.2]鑒定程序西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程包括田間取樣、癥狀檢查、病原菌的鑒定、過程記錄及檔案保存4個階段。程序流程如圖1所示。圖1 西瓜枯萎病菌鑒定流程圖田間取樣(但尚未完全枯死4~8癥狀檢查癥狀檢查操作如下:觀察病株葉部有無西瓜枯萎病的可疑癥狀(見附錄A),如出現(xiàn)葉片萎蔫、發(fā)黃、干枯等。用小刀進行縱切和橫切病株根部病健交界處,觀察有無西瓜枯萎病的可見癥狀(見附錄A),如基部有褐色條斑或發(fā)生表皮縱裂、維管束變褐等。(4病原菌的鑒定實驗用儀器設(shè)備和主要試劑的準(zhǔn)備實驗儀器實驗儀器包括生物顯微鏡、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機、PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、-804-20(0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL)等。主要試劑除另有規(guī)定外,所有試劑均為分析純或生化試劑?!?NaClO7530DNAPCR——試驗中除PCR試驗所用的試劑配制為三級水外,其他用水均為一級水?!R鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)(配制方法見附錄B)。病原菌的培養(yǎng)直接培養(yǎng)將樣本根部用75%酒精進行消毒處理30s后,用無菌水沖洗3遍,用1%瓊脂進行保濕,置于28℃條件下培養(yǎng)2d~4d。分離培養(yǎng)將病株根部或莖部病健交界處切成5mm左右的小塊,在1NaClO溶液中浸泡2min,用75%酒精浸泡15s,無菌水沖洗3次,滅菌濾紙片吸干水分后放置在PSA培養(yǎng)基上,用parafilm膜封口,置于28d~3d。用挑針挑取單根菌絲接種到新鮮PSA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)5d。按照附錄C形態(tài)學(xué)鑒定用滅菌牙簽挑取按照7.2條培養(yǎng)獲得的菌絲及分生孢子,制成臨時玻片,在生物顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征(見附錄D)。病菌在PSA4d~5d分子生物學(xué)鑒定PSA5CTAB(見附錄E)提取可疑分離物DNA。將提取得到的DNA用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、ACT-512F/ACT-783R作為引物分別擴增病原菌菌株的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(thenuclearribosomalinternaltranscribedspacerregion,ITS)、翻譯延伸因子(translationelongationfactor1-a,TEF-1)、組蛋白(histoneH3,HIS)、肌動蛋白基因(actingenes,ACT)。將所獲得的片段提交測序,并根據(jù)參考序列信息構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見附錄F),從而確定可疑分離物的種類。結(jié)果判定應(yīng)采用形態(tài)學(xué)檢測和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法,進行結(jié)果判定。分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征符合7.3條描述,且根據(jù)ITS、TEF-1、HIS、ACT序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,與西瓜枯萎病菌參考菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠聚到一個分支上,且置信度大于95fsp。分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征符合7.3條描述,但根據(jù)ITS、TEF-1、HIS、ACT序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,與西瓜枯萎病菌參考菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,能夠聚到一個分支上,但置信度不大于95sp。分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征不符合7.3條描述,可判定未檢出西瓜枯萎病菌fsp。病原菌的保存從檢測樣品中分離并鑒定為西瓜枯萎病菌的菌株應(yīng)妥善保存。將菌株接種于PSA培養(yǎng)基斜面上,在283d4-80℃超低溫冰箱中冷凍保存;或收集菌絲進行真空干燥后于-20℃冰箱中低溫保存。試驗結(jié)果記錄((等;8 過程記錄及檔案保存((和(附 錄 A(資料性)西瓜枯萎病危害癥狀d~2d,早晚尚病株癥狀 b)病株維管束病狀圖A.1 西瓜枯萎病田間發(fā)病癥狀附 錄 B(資料性)馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)配制方法將洗凈后去皮的馬鈴薯200g切成1cm左右的小塊,加水1000mL煮沸20min,用4層紗布過濾去除馬鈴薯泥,然后加入20g蔗糖,融化后定容至1000mL,加入10g~15g瓊脂后加熱使瓊脂完全溶化,將配制好的培養(yǎng)基分裝到三角瓶中,塞好棉塞后用牛皮紙袋包裹,置于121℃高壓滅菌20min。附 錄 C(規(guī)范性)西瓜枯萎病菌致病性測定選取疑似枯萎病或者測序結(jié)果為枯萎病菌的純培養(yǎng)菌落,采用浸根法接種。將處于子葉平展期的西瓜苗根系漂洗干凈后,在6×106個孢子·mL-1的孢子懸浮液中浸根15min,期間搖動孢子懸浮液3次。對照植株在無菌水中浸根15min。接種后幼苗移栽至經(jīng)過121℃高壓濕熱滅菌2h的過篩土和草炭(1:1)混合的基質(zhì)中。在人工氣候室中培養(yǎng),溫度26℃/22℃(日/夜),光照14h/10h(日/夜),相對濕度60%,每個處理接種6株,3次重復(fù),接種3d后剔除萎蔫和枯死的幼苗。接種4d后開始調(diào)查記錄發(fā)病情況,21d內(nèi)持續(xù)觀察幼苗發(fā)病情況以確認(rèn)分離菌株的致病性。附 錄 D(資料性)西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征f.sp.屬半知菌亞門真菌。病菌產(chǎn)生三種類型的孢子。病菌在PSA培養(yǎng)基平板上菌落突起,白色致密呈絮狀,菌絲體為有隔菌絲、無色,在培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d~5d出現(xiàn)粉紅色,小型分生孢子無色、長橢圓形、單胞或偶有一個分隔。大型分生孢子鐮刀形、無色、有1個~5個隔膜、多數(shù)為3個隔膜。西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征見圖D.1。菌落正面形態(tài) b)菌落背面形態(tài)c)大型分生孢子 d)小型分生孢子圖D.1 西瓜枯萎病菌形態(tài)附 錄 E(資料性)西瓜枯萎病菌DNA的提取DNA提取步驟如下:將待測菌株于285d后,收集菌絲;CTAB將破碎管放于6530min,中間顛倒混勻2次;加入等體積的苯酚/氯仿/(體積比為10min;吸取上清液至1.5mL離心管中,重復(fù)步驟d)一次;加入2倍或2.5倍的預(yù)冷無水乙醇和1/103MNaAc(pH5.2)(或用0.6倍的預(yù)冷異丙醇沉淀),室溫沉淀20min,12000rpm/min離心10min;用70%的乙醇洗滌沉淀兩次;40L或含RNsNandrop檢測DNA的純度和濃度后,保存于-20附 錄 F(資料性)西瓜枯萎病菌PCR檢測PCRDNAITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、ACT-512F/ACT-783RITS、TEF-1、HIS、ACT(F.1)。表F.1真菌鑒定用引物信息擴增基因引物名稱引物序列退火溫度(℃)參考文獻ITSITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’54500-750Whiteetal.,1990ITS45’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’EFEF1-728F5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’52300-450Carbone&Kohn,1999EF1-986R5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’ACTACT-512F5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’56300-450Crousetal.,2004ACT-783R5’-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3’HISCYLH3F5’-AGGTCCACTGGTGGCAAG-3’54350-400Carbone&Kohn,1999CYLH3R5’-AGCTGGATGTCCTTGGACTG-3’反應(yīng)體系:基因組DNA(20ng)1μLForardPrier10μmo·)2μLRevrs

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