第三章 病毒課件

4第三章病毒第三章

病毒第一節(jié)概述第二節(jié)毒粒的性質(zhì)第三節(jié)病毒的復(fù)制第四節(jié)病毒的非增殖性感染4第三章病毒一、病毒學(xué)第一節(jié)概述極大地豐富了現(xiàn)代生物學(xué)（微生物學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)）的理論與技術(shù)；病毒學(xué)（virulogy）：研究病毒（virus）的本質(zhì)及其與宿主的相互作用的科學(xué)，是微生物學(xué)的重要分支學(xué)科。有效地控制和消滅人及有益生物的病毒病害；利用病毒對有害生物、特別是害蟲進(jìn)行生物防治；發(fā)展以基因工程為中心的生物高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)；4第三章病毒二、病毒的特點和定義第一節(jié)概述1、特點1）不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有一般化學(xué)大分子的特征。2）一種病毒的毒粒內(nèi)只含有一種核酸，DNA或者RNA。3）大部分病毒沒有酶或酶系極不完全，不含催化能量代謝的酶，不能進(jìn)行獨立的代謝作用。4）嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生，沒有自身的核糖體，沒有個體生長，也不進(jìn)行二均分裂，必須依賴宿主細(xì)胞進(jìn)行自身的核酸復(fù)制，形成子代。5）個體微小，在電子顯微鏡下才能看見。6）對大多數(shù)抗生素不敏感，對干擾素敏感。例如一些簡單的病毒僅由核酸和蛋白質(zhì)外殼（coat）構(gòu)成，故可把它們視為核蛋白分子。朊病毒甚至僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成例如利福平可抑制痘病毒復(fù)制病毒感染敏感宿主細(xì)胞后，病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞，通過其復(fù)制與表達(dá)產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì)，然后由這些新合成的病毒組分裝配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式釋放到細(xì)胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制（replication）。4第三章病毒第一節(jié)概述1.特點二、病毒的特點和定義病毒是一類既具有化學(xué)大分子屬性，又具有生物體基本特征；既具有細(xì)胞外的感染性顆粒形式，又具有細(xì)胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。超顯微的、沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的、專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的實體4第三章病毒第一節(jié)概述1.特點二、病毒的特點和定義

單細(xì)胞微生物與病毒性質(zhì)的比較aDNA病毒和RNA病毒中的一部分;b利福平可抑制痘病毒復(fù)制4第三章病毒第一節(jié)概述2.定義二、病毒的特點和定義迄今仍無一個科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩x病毒為具有獨立于其宿主的進(jìn)化史的絕對細(xì)胞內(nèi)寄生物，它的DNA或RNA基因組被其所編碼的蛋白質(zhì)殼體化（encapsidation）。（Fields等，1990年）非細(xì)胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白質(zhì)二種組分亞病毒類病毒：只含具侵染性的RNA組分衛(wèi)星RNA：只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒：只含蛋白質(zhì)4第三章病毒三、病毒的宿主范圍第一節(jié)概述病毒幾乎可以感染所有的細(xì)胞生物，并具有宿主特異性噬菌體（phage）、植物病毒（plantviruses）動物病毒（animalviruses）4第三章病毒四、病毒的培養(yǎng)和純化第一節(jié)概述同微生物學(xué)其他學(xué)科分支一樣，病毒學(xué)的進(jìn)步完全得益于研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展。通過病毒的分離與純化獲得純化的、有感染性的病毒制備物是病毒學(xué)研究和實踐的基本技術(shù)。1.病毒的培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)：二元培養(yǎng)物法4第三章病毒四、病毒的培養(yǎng)和純化

1.病毒的培養(yǎng)噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)液營養(yǎng)瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮細(xì)菌平板成為殘跡平板若是噬菌體標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，即噬斑（plague）。如同對細(xì)菌計數(shù)一樣，形成的噬菌斑也可用于對噬菌體的數(shù)目進(jìn)行估算。4第三章病毒四、病毒的培養(yǎng)和純化

1.病毒的培養(yǎng)動物病毒實驗動物雞胚多種細(xì)胞培養(yǎng)4第三章病毒四、病毒的培養(yǎng)和純化

1.病毒的培養(yǎng)若標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)稀釋進(jìn)行接種并輔以染色處理，病毒可在培養(yǎng)的細(xì)胞單層上形成肉眼可見的局部病損區(qū)域，即蝕斑（plaque）或稱空斑。大多數(shù)動物病毒感染敏感細(xì)胞培養(yǎng)能引起其顯微表現(xiàn)的改變，即產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect,CPE），例如細(xì)胞聚集成團、腫大、圓縮、脫落，細(xì)胞融合形成多核細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體（inclusionbody），乃至細(xì)胞裂解等。4第三章病毒四、病毒的培養(yǎng)和純化

1.病毒的培養(yǎng)植物病毒敏感植物葉片產(chǎn)生壞死斑，或稱枯斑4第三章病毒蛋白質(zhì)提純方法（鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等）四、病毒的培養(yǎng)和純化

2.病毒純化標(biāo)準(zhǔn)純化的病毒制備物應(yīng)保持其感染性病毒是有感染性的生物體病毒具有化學(xué)大分子的屬性純化的病毒制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性方法主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)具有一定的大小、形狀和密度差速離心梯度離心（超速離心）4第三章病毒第二節(jié)病毒的性質(zhì)病毒粒子：毒粒

一團能夠自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)保護遺傳物質(zhì)免遭環(huán)境破壞，并作為將遺傳物質(zhì)從一個宿主細(xì)胞傳遞給另一個宿主細(xì)胞的載體。蛋白質(zhì)外殼包膜4第三章病毒第二節(jié)病毒的性質(zhì)一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)1.病毒的大小和形狀個體小，必需在電鏡下觀察；不同病毒的毒粒大小差別很大；毒粒的形狀大致可分球形顆粒(或稱擬球形顆粒)、桿狀顆粒和復(fù)雜形狀顆粒（如蝌蚪狀，卵形）等幾類。4第三章病毒幾種病毒的形態(tài)和相對大小4第三章病毒采用各種電鏡技術(shù)觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)Orfvirus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎病毒)（負(fù)染技術(shù)）Ebolavirus：埃博拉病毒（正染技術(shù)）Vacciniavirus

痘苗病毒（投影技術(shù)）4第三章病毒第二節(jié)病毒的性質(zhì)一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)2.病毒的殼體結(jié)構(gòu)殼體或衣殼（capsid）：包圍著病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼，由蛋白質(zhì)亞基按對稱的形式、有規(guī)律地排列而成，是病毒毒粒的基本結(jié)構(gòu)。殼體結(jié)構(gòu)類型螺旋對稱殼體二十面體對稱殼體雙對稱結(jié)構(gòu)4第三章病毒螺旋對稱殼體：亞基有規(guī)律地沿著中心軸（核酸）呈螺旋排列，進(jìn)而形成高度有序、對稱的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。4第三章病毒多面體對稱殼體：構(gòu)成對稱結(jié)構(gòu)殼體的第二種方式是蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對稱的正多面體的角或邊排列，進(jìn)而形成一個封閉的蛋白質(zhì)的鞘。4第三章病毒具有雙對稱結(jié)構(gòu)的典型例子是有尾噬菌體（tailedphage）,其殼體由頭部和尾部組成。包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對稱，尾部呈螺旋對稱。4第三章病毒第二節(jié)病毒的性質(zhì)一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)3.病毒的包膜結(jié)構(gòu)病毒的蛋白質(zhì)殼體和病毒核酸（核心）構(gòu)成的復(fù)合物，又稱核衣殼。核殼（nucleocapsid）：僅由核衣殼構(gòu)成的病毒顆粒裸露毒粒（nakedvirion）：如煙草花葉病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）等一些簡單的病毒的毒粒。包膜（envelope）：有些病毒核衣殼被一層脂蛋白膜包裹著，它是病毒以出芽方式成熟時，由細(xì)胞膜衍生而來的。有維系毒粒結(jié)構(gòu)，保護病毒核殼的作用。特別是病毒的包膜糖蛋白，具有多種生物學(xué)活性，是啟動病毒感染所必需的。有包膜的病毒4第三章病毒一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)3.病毒的包膜結(jié)構(gòu)病毒包膜的基本結(jié)構(gòu)與生物膜相似，是脂雙層膜。也稱封套或囊膜。主要成分為磷脂，此外還有糖脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛、膽固醇。囊膜一般為脂質(zhì)雙層膜，與這些膜相聯(lián)的是病毒特異性蛋白。這些病毒特異性蛋白在病毒感染和復(fù)制過程中發(fā)揮作用。囊膜表面往往具有突起物，稱刺突(spike)或包膜子粒(peplomer)。囊膜對一些脂溶劑如乙醚、氯仿等敏感。有囊膜的病毒有利于其吸附寄主細(xì)胞，破壞宿主細(xì)胞表面受體，使病毒易于侵入細(xì)胞。4第三章病毒第二節(jié)病毒的性質(zhì)一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)4.病毒的結(jié)構(gòu)類型四種主要結(jié)構(gòu)類型裸露的二十面體毒粒；裸露的螺旋毒粒；有包膜的二十面體毒粒；有包膜的螺旋毒粒；有些病毒，如有尾噬菌體、痘病毒等結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，不能包括在這些結(jié)構(gòu)類型之內(nèi)。不同病毒的毒粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有很大的區(qū)別4第三章病毒第二節(jié)病毒的性質(zhì)二、病毒的化學(xué)組成病毒（化學(xué)組成）核酸；蛋白質(zhì)；脂類；碳水化合物；基本化學(xué)組成4第三章病毒二、病毒的化學(xué)組成1.病毒的核酸核酸是病毒的遺傳物質(zhì)；一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或是RNA；病毒核酸單鏈DNA（ssDNA）；雙鏈DNA（dsDNA）；單鏈RNA（ssRNA）；雙鏈RNA（dsRNA）；4第三章病毒二、病毒的化學(xué)組成2.病毒的蛋白質(zhì)病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白非結(jié)構(gòu)蛋白由病毒基因組編碼的，在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生并具有一定功能，但并不結(jié)合于毒粒中的蛋白質(zhì)。構(gòu)成一個形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)殼體蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；4第三章病毒二、病毒的化學(xué)組成2.病毒的蛋白質(zhì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的主要生理功能：1）構(gòu)成蛋白質(zhì)外殼，保護病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子的破壞；2）決定病毒感染的特異性，與易感細(xì)胞表面存在的受體具特異性親和力，促使病毒粒子的吸附和入侵；3）決定病毒的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體；4）構(gòu)成毒粒酶，或參與病毒對宿主細(xì)胞的入侵（如T4噬菌體的溶菌酶等），或參與病毒復(fù)制過程中所需要病毒大分子的合成（如逆轉(zhuǎn)錄酶等）；一般來說，病毒是不具酶或酶系極不完全的，所以一旦離開宿主就不能獨立進(jìn)行代謝和繁殖。4第三章病毒第三節(jié)病毒的復(fù)制病毒的特點：嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生物，只能在活細(xì)胞內(nèi)繁殖。毒粒宿主細(xì)胞有繁殖性的病毒基因組具有感染性的毒粒消失病毒基因組復(fù)制、表達(dá)病毒核酸和蛋白質(zhì)裝配形成具有感染性的毒粒釋放至細(xì)胞外原料；能量；生物合成場所；4第三章病毒第三節(jié)病毒的復(fù)制病毒的復(fù)制：病毒感染敏感宿主細(xì)胞后，病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞，通過其復(fù)制與表達(dá)產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì)，然后由這些新合成的病毒組分裝配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式釋放到細(xì)胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制（replication）。4第三章病毒第三節(jié)病毒的復(fù)制一、病毒的復(fù)制周期1、一步生長曲線（onestepgrowthcurve）1939年，MaxDelbruck&EmoryEllis：E.coli/bacteriopage1、用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細(xì)胞；2、數(shù)分鐘后，加入抗噬菌體的抗血清（中和未吸附的噬菌體）；3、將上述混合物大量稀釋，終止抗血清的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細(xì)胞；4、保溫培養(yǎng)并定期檢測培養(yǎng)物中的噬菌體效價（對噬菌體含量進(jìn)行計數(shù)）；5、以感染時間為橫坐標(biāo)，病毒的感染效價為縱坐標(biāo)，繪制出病毒特征性的繁殖曲線；該實驗標(biāo)志著分子病毒學(xué)、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的建立MaxDelbruck因此榮獲1969年NobelPrize4第三章病毒一、病毒的復(fù)制周期1、一步生長曲線（onestepgrowthcurve）噬菌體復(fù)制（繁殖）的三個階段：1、吸附期；游離的噬菌體吸附到宿主細(xì)胞2、潛伏期；從噬菌體吸附到細(xì)胞到釋放出新噬菌體的最短時期3、裂解期；隨著菌體不斷破裂，新噬菌體數(shù)目增加，直到最高值4第三章病毒一、病毒的復(fù)制周期1、一步生長曲線（onestepgrowthcurve）取培養(yǎng)物直接測定病毒數(shù)量將培養(yǎng)物過濾去細(xì)胞后測定病毒數(shù)量將細(xì)胞裂解后測定病毒的數(shù)量。前期可將培養(yǎng)物先離心去上清以消除未吸附病毒的影響裂解量：每個受染細(xì)胞所產(chǎn)生的子代病毒顆粒的平均數(shù)目。其值等于潛伏期受染細(xì)胞的數(shù)目除以穩(wěn)定期受染細(xì)胞所釋放的全部子代病毒數(shù)目，即等于穩(wěn)定期病毒效價與潛伏期病毒效價之比。4第三章病毒一、病毒的復(fù)制周期2、隱蔽期（eclipseperiod）在潛伏期的前一段，受染細(xì)胞內(nèi)檢測不到感染性病毒，后一階段，感染性病毒在受染細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量急劇增加。自病毒在受染細(xì)胞內(nèi)消失到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)新的感染性病毒的時間為為隱蔽期。隱蔽期病毒在細(xì)胞內(nèi)存在的動力學(xué)曲線呈線性函數(shù)，而非指數(shù)關(guān)系，從而證明子代病毒顆粒是由新合成的病毒基因組與蛋白質(zhì)經(jīng)裝配成熟，而不是通過雙分裂方式產(chǎn)生的。不同病毒的隱蔽期長短不同，例如，DNA動物病毒的隱蔽期為5～20小時，RNA動物病毒為2～10小時。4第三章病毒一、病毒的復(fù)制周期1、一步生長曲線（onestepgrowthcurve）一步生長曲線是研究病毒復(fù)制的一個經(jīng)典試驗，最初是為研究噬菌體的復(fù)制而建立，以后推廣到動物病毒和植物病毒的復(fù)制研究中。以適量的病毒接種于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的高濃度的敏感細(xì)胞，待病毒吸附后，離心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清處理病毒—細(xì)胞培養(yǎng)物以建立同步感染，然后繼續(xù)培養(yǎng)并定時取樣測定培養(yǎng)物中的病毒效價，并以感染時間為橫坐標(biāo)，病毒的感染效價為縱坐標(biāo)，繪制出病毒特征性的繁殖曲線，即一步生長曲線。不同病毒的潛伏期長短不同，噬菌體以分鐘計，動物病毒和植物病毒以小時或天計。潛伏期：噬菌體的裂解量一般為幾十到上百個，植物病毒和動物病毒可達(dá)數(shù)百乃至上萬個。裂解量：4第三章病毒一、病毒的復(fù)制周期3、病毒的復(fù)制周期復(fù)制周期（replicativecircle）或稱復(fù)制循環(huán)：自病毒吸附于細(xì)胞開始，到子代病毒從感染細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的病毒復(fù)制過程。①吸附；

②侵入；

③脫殼；

④病毒大分子的合成，包括病毒基因組的表達(dá)與復(fù)制；⑤裝配與釋放；4第三章病毒第三節(jié)病毒的復(fù)制二、病毒感染的起始1、吸附：毒粒敏感細(xì)胞隨機碰撞而接觸（靜電引力或氫鍵）可逆吸附，無特異性（非細(xì)胞顆粒也可吸附）病毒表面蛋白與細(xì)胞受體的結(jié)合特異性，不可逆吸附，啟動病毒感染的第一階段4第三章病毒二、病毒感染的起始1、吸附：病毒吸附蛋白與細(xì)胞受體間的結(jié)合力來源于空間結(jié)構(gòu)的互補性，相互間的電荷、氫鍵、疏水性相互作用及范得華力。不同種系的細(xì)胞具有不同病毒的細(xì)胞受體，病毒受體的細(xì)胞種系特異性決定了病毒的宿主范圍。4第三章病毒二、病毒感染的起始1、吸附：動物宿主細(xì)胞及細(xì)菌表面病毒受體的存在可通過生化、遺傳等實驗證明，但至今仍未發(fā)現(xiàn)植物病毒的細(xì)胞受體存在。4第三章病毒二、病毒感染的起始2、侵入：侵入又稱病毒內(nèi)化，它是一個病毒吸附后幾乎立即發(fā)生，依賴于能量的感染步驟。不同的病毒-宿主系統(tǒng)的病毒侵入機制不同4第三章病毒二、病毒感染的起始2、侵入：有尾噬菌體：注射方式將噬菌體核酸注入細(xì)胞通過尾部刺突固著于細(xì)胞；尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，使細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；吸附尾釘固著尾鞘收縮尾管穿入DNA注入如果大量噬菌體在短時間內(nèi)吸附于同一細(xì)胞上，使細(xì)胞壁產(chǎn)生許多小孔，也可引起細(xì)胞立即裂解，但并未進(jìn)行噬菌體的增殖，這種現(xiàn)象稱為自外裂解（lysisfromwithout）。4第三章病毒二、病毒感染的起始2、侵入：植物病毒：通過因人為地或自然的機械損傷所形成的微傷口進(jìn)入細(xì)胞；或者靠攜帶有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆蟲取食將病毒帶入細(xì)胞。植物病毒一旦進(jìn)入細(xì)胞后，增殖產(chǎn)生的子代病毒或病毒核酸可通過病毒編碼的運動蛋白（movementprotein）與胞間連絲的相互作用從受染細(xì)胞進(jìn)入鄰近細(xì)胞。4第三章病毒二、病毒感染的起始3、脫殼：脫殼是病毒侵入后，病毒的包膜和/或殼體除去而釋放出病毒核酸的過程。脫殼是病毒基因組進(jìn)行功能表達(dá)所必需的感染事件。T-偶數(shù)噬菌體脫殼與侵入是一起發(fā)生的動物病毒存在不同的結(jié)構(gòu)類型和不同的侵入方式，其脫殼過程也較復(fù)雜。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，進(jìn)入潛隱期。4第三章病毒第三節(jié)病毒的復(fù)制三、病毒大分子的合成病毒基因組的表達(dá)與復(fù)制存在著強烈的時序性病毒基因組進(jìn)入胞內(nèi)宿主細(xì)胞的代謝發(fā)生改變病毒利用宿主的生物合成機構(gòu)和場所，使病毒核酸表達(dá)和復(fù)制，產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。4第三章病毒三、病毒大分子的合成病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成病毒復(fù)制所需要的病毒特異性酶蛋白及蛋白質(zhì)外殼的合成（5種核酸，6條途徑）4第三章病毒四、病毒的裝配與釋放第三節(jié)病毒的復(fù)制新合成的毒粒結(jié)構(gòu)組分組裝成完整的病毒顆粒，稱做病毒的裝配，亦稱成熟（maturation）或形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）。成熟的子代病毒顆粒然后依一定途徑釋放到細(xì)胞外病毒的釋放標(biāo)志病毒復(fù)制周期結(jié)束4第三章病毒四、病毒的裝配與釋放T4噬菌體的裝配是一個極為復(fù)雜的自我裝配的過程4第三章病毒吸附侵入早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成裝配釋放病毒大分子合成4第三章病毒第四節(jié)病毒的非增殖性感染增殖性感染（productiveinfection）：感染發(fā)生在病毒能在其內(nèi)完成復(fù)制循環(huán)的允許細(xì)胞內(nèi)，并以