實驗猴寄生蟲病防治技術(shù)規(guī)范

實驗猴寄生蟲病防治技術(shù)規(guī)范范圍本文件界定了實驗猴寄生蟲病防治涉及的術(shù)語和定義，規(guī)定了人工馴繁養(yǎng)殖實驗猴寄生蟲病的診斷方法、防治要求、驅(qū)治方法和監(jiān)測等內(nèi)容。本標準適用于廣西行政區(qū)域內(nèi)人工馴繁養(yǎng)殖實驗猴寄生蟲病的防治。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18448.2-2008實驗動物弓形蟲檢測方法GB/T18448.7-2008實驗動物瘧原蟲檢測方法GB/T18448.9-2008實驗動物腸道溶組織內(nèi)阿米巴檢測方法GB18596-2001畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標準GB19489-2008實驗室生物安全通用要求GB/T27401-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫NY/T1168-2006畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T1949-2010隱孢子蟲卵囊檢測技術(shù)改良抗酸染色法T/CALAS106-2021實驗動物結(jié)腸小袋纖毛蟲核酸檢測方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。

實驗猴laboratorymonkey由人工飼育，對其攜帶的微生物進行控制，遺傳背景明確或者來源清楚的，用于科學研究、教學、生產(chǎn)、檢定以及其他科學實驗的動物。實驗猴主要包括食蟹猴和獼猴。

寄生蟲病parasitosis由動物界包括原生動物的各種寄生性的無脊椎物種（統(tǒng)稱寄生蟲）引起的疾病。

優(yōu)勢蟲種superiorityparasite在一定地區(qū)，某一種動物所感染的寄生蟲蟲種當中，感染分布廣、且危害嚴重的主要寄生蟲蟲種。

蠕蟲病helminthosis由吸蟲、絳蟲、線蟲、棘頭蟲引起的寄生蟲病。

原蟲病protozoosis由溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、球蟲、隱孢子蟲等引起的寄生蟲病。

體外寄生蟲ectoparasite寄生于動物體外并暫時性吸取營養(yǎng)的寄生蟲。如螨、虱等。診斷方法直接涂片法在載玻片上滴加一滴生理鹽水，用竹簽挑取少許被檢實驗猴新鮮糞便，或者用刀片刮下少許皮屑，將糞便或者皮屑在生理鹽水中涂抹均勻，置于光學顯微鏡下檢查，或解剖動物后立即用接種環(huán)挑取新鮮小腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物或病變組織，分別與生理鹽水混合涂成薄而均勻的薄膜，蓋上蓋玻片后于顯微鏡下檢查。此方法適用于大多數(shù)蟲卵檢測。水洗沉淀法取被檢糞便10～15g于塑料杯中，加水20mL～30mL攪拌成混懸液，用60目銅篩過濾到100mL三角燒杯中，再加入適量蒸餾水充分攪拌混勻，靜置15min，倒去上清液，向沉渣中再加入蒸餾水，調(diào)勻、靜置15min。重復(fù)3～4次，直至上層液變清。最后倒去上清液，取沉渣涂片鏡檢。此方法適用于大多數(shù)蟲卵檢測。XX碘液染色法取少許新鮮糞便或用吸管吸取4.2水洗沉淀法的量杯底部沉淀物1滴，加XX碘液工作液（按附錄A進行）1滴，攪勻，蓋上蓋玻片后，在10×和40×光學顯微鏡下測量觀察。此方法適用于溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、鞭毛蟲等原蟲檢測。飽和蔗糖漂浮離心法取被檢糞便5g～10g于塑料杯中，加入10mL～20mL自來水充分攪勻，經(jīng)過60目銅絲篩過濾，濾液裝入離心管中，3000rpm離心5min，棄上清，加入適量配置好的飽和蔗糖溶液（按附錄A進行），充分攪拌，使下層沉淀和蔗糖液充分混勻，3000rpm離心5min～10min。用鐵絲吊環(huán)蘸取表層液膜，涂于載玻片上，制片后于10×和40×光學顯微鏡下觀察、測量。此方法適用于隱孢子蟲、鞭蟲的檢測。蟲體濃集法取病料于試管內(nèi)，加入10％氫氧化鈉自熱浸泡過夜或加熱煮沸3min～5min，使皮屑溶解，蟲體沉淀管內(nèi)，靜置20min，棄上清，吸取沉淀，涂于載玻片上，在10×和40×光學顯微鏡下測量觀察。此方法適用于螨蟲檢測。環(huán)介導等溫擴增法取待檢實新鮮糞便2.0g～5.0g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本100mg～300mg至2mL離心管中，按糞便基因組DNA提取說明書提取模板DNA。按照LAMP擴增反應(yīng)試劑盒配制反應(yīng)體系，將已配制好、分裝完畢的反應(yīng)試管置于實時濁度儀（LA-320C，日本榮研公司）密閉進行，濁度儀實時監(jiān)控擴增情況，反應(yīng)程序為63℃保持60min，之后85℃滅活5min。儀器通過讀取反應(yīng)管的濁度值繪制濁度曲線，在陰陽性對照成立的情況下，樣品反應(yīng)管出現(xiàn)濁度上升曲線的為可檢測出其目的基因，判為陽性，反之為陰性。防治要求人員要求防控的技術(shù)人員要經(jīng)過相關(guān)的技術(shù)培訓，嚴格遵守操作規(guī)程，每年體檢一次，做好人畜防護安全工作。設(shè)施、設(shè)備要求藥浴池要防滲漏，要求建在地勢較低處，并遠離人畜飲水水源。藥浴、藥淋設(shè)備應(yīng)按操作要求使用。驅(qū)蟲前、浴前、淋前要求先進行小群試驗，確認安全后方可大群驅(qū)蟲、藥浴或藥淋。引進猴要求必須從外場引進猴群時，要確認產(chǎn)地為非疫區(qū)。引進后隔離飼養(yǎng)45d以上，進行觀察、檢疫、監(jiān)測，并進行一次驅(qū)蟲，收集糞便進行發(fā)酵處理。確認為健康后方可與健康猴混群。藥物使用要求藥物配制、使用劑量和使用方法要嚴格按照使用說明書進行。要嚴格按照說明書執(zhí)行休藥期，對未規(guī)定休藥期的藥物，休藥期不應(yīng)少于28d。飼養(yǎng)管理要求幼猴與成年猴應(yīng)分開飼養(yǎng)，以減少感染機會。供給全價營養(yǎng)飼料，合理補充青料和必要的添加劑，增強猴只抵抗力。病猴應(yīng)及時隔離治療，嚴禁混群飼養(yǎng)，以防感染傳播。其他要求驅(qū)蟲過程中，應(yīng)跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)中毒、傷殘猴應(yīng)及時采取解毒等治療措施，具體治療措施按附錄D進行。驅(qū)蟲藥物的選擇藥物的選擇和使用必須符合《中華人民共和國獸藥典》、《中華人民共和國獸藥規(guī)范》、《獸藥質(zhì)量標準》（第一冊）、（第二冊）、《進口獸藥質(zhì)量標準》的相關(guān)規(guī)定。所用獸藥必須來自具有《獸藥生產(chǎn)許可證》和產(chǎn)品批準文號的生產(chǎn)企業(yè)，或者具有《進口獸藥許可證》的供應(yīng)商。所用獸藥的標簽應(yīng)符合《獸藥管理辦法》的規(guī)定。選用的藥物要符合高效、廣譜、安全、價廉、使用方便的原則。定期預(yù)防性驅(qū)蟲，要選擇對優(yōu)勢蟲種均有效的藥物，如一種藥物不能滿足要求，可以選擇2種或2種以上藥物同時使用，但要注意藥物配伍禁忌，盡量選擇長效驅(qū)蟲藥制劑。圈舍滅蟲及廢棄物無害化處理圈舍滅蟲定期在空舍條件下，對圈舍墻壁、地面、圍欄、用具、飼喂工具等噴灑殺蟲藥，能進行火焰消毒的耐高溫設(shè)施選用火焰消毒法，以殺滅圈舍內(nèi)的寄生蟲卵?？膳c投藥、藥浴、藥淋同步進行對圈舍墻壁、地面、圍欄、用具、飼喂工具等噴灑殺蟲藥或火焰消毒，也可以根據(jù)發(fā)病情況或具體情況隨時進行。廢棄物無害化處理圈舍內(nèi)糞便要及時清除，糞便集中堆積發(fā)酵處理，利用生物熱殺滅各種寄生蟲和蟲卵，達到消滅傳染源，保障人畜健康及環(huán)境安全。糞便處理應(yīng)符合NY/T1168的規(guī)定；污水處理符合GB18596的規(guī)定。病猴尸體及廢棄物按《病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范》規(guī)定執(zhí)行，嚴禁將未經(jīng)處理的病猴尸體、廢棄物直接喂犬或隨地拋棄。驅(qū)治方法蠕蟲病采用高效驅(qū)蟲藥每年全群驅(qū)蟲，一年進行三次，第一次在春季（3～4月），第二次在夏季（7～8月），氣溫較高，猴群在室外運動頻繁時期進行，第三次在秋冬季（11～12月）。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進行。原蟲病采用高效抗驅(qū)蟲藥每年全群驅(qū)蟲，一年進行2～4次，春季（3～4月），秋季（9～10月），根據(jù)寄生蟲的流行情況適當調(diào)整。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進行。螨蟲病發(fā)現(xiàn)病猴后及時隔離治療，選擇長效驅(qū)蟲藥，一年進行三次，分別在1月、3月、10月進行驅(qū)蟲，至少用藥2次，用藥間隔7d～8d。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進行。監(jiān)測抽樣數(shù)量及比例猴群監(jiān)測（以猴群為單位），抽樣數(shù)量為猴數(shù)量的5％～10％，其中幼猴30％，種猴40％，青年（商品用）猴30％。對規(guī)模小于100只的猴群，抽樣數(shù)量不應(yīng)少于10只。監(jiān)測時間蠕蟲及原蟲在驅(qū)蟲前1周內(nèi)或驅(qū)蟲后7d～15d內(nèi)進行監(jiān)測，對出售的商品猴群隨時進行監(jiān)測。螨蟲等體外寄生蟲在每年秋末春初，冬季高發(fā)季節(jié)監(jiān)測。監(jiān)測方法蠕蟲采用糞便檢查孕卵節(jié)片、幼蟲和蟲卵的方法，對病死猴可采用全身性蠕蟲學檢查法；原蟲采用直接直接涂片法、水洗沉淀法、XX碘液染色法、飽和蔗糖漂浮離心法等，其中溶組織內(nèi)阿米巴可采用溶組織內(nèi)阿米巴核酸檢測方法（見附錄B），結(jié)腸小袋纖毛蟲按T/CALAS106-2021進行檢測，弓形蟲按照GB/T18448.2進行檢測，瘧原蟲按照GB/T18448.7進行檢測；體外寄生蟲采用直接檢查法、蟲體濃集法等。監(jiān)測指標及計算方法防治（驅(qū)蟲）密度防治（驅(qū)蟲）密度按式（1）計算： M％=Q1Y1×100 式中：M—防治（驅(qū)蟲）密度；Q1—防治（驅(qū)蟲）猴數(shù)；Y1—猴群總數(shù)量。感染率感染率按式（2）計算： G％=Y2Y3×100 式中：G—感染率；Y2—感染某種蟲的猴數(shù)量；Y3—抽檢猴的數(shù)量。蟲卵（包囊）減少率蟲卵（包囊）減少率按式（3）計算： C％=Q2?Q3Q2×100 式中：C—蟲卵（包囊）減少率；Q2—驅(qū)蟲前每克糞便中的蟲卵（包囊）數(shù)；Q3—驅(qū)蟲后每克糞便中的蟲卵（包囊）數(shù)。蟲卵轉(zhuǎn)陰數(shù)蟲卵（包囊）轉(zhuǎn)陰數(shù)按式（4）計算： Y％=Y4Y3×100 式中：Y—蟲卵（包囊）轉(zhuǎn)陰率；Y3—抽檢猴的數(shù)量；Y4—轉(zhuǎn)陰猴的數(shù)量。監(jiān)測評價根據(jù)監(jiān)測指標及計算結(jié)果，了解實驗猴寄生蟲流行情況，指導驅(qū)蟲并對驅(qū)蟲效果進行評價。檔案管理建立防治檔案，檔案記錄內(nèi)容包括防治數(shù)量、用藥品種、使用劑量、環(huán)境與糞便無害化處理、發(fā)病率、病死率及死亡原因、診治情況等。

（規(guī)范性）

試劑的配制XX碘液儲存液配制方法按照GB/T18448.9-2001的規(guī)定進行配制。XX碘液工作液配制方法取A.1儲存液5mL，加入20mL生理鹽水，混勻后儲存于棕色玻璃瓶中，隨用隨取。飽和蔗糖溶液配制方法按照NY/T1949-2010中附錄A的規(guī)定進行配制。

（資料性）

腸道溶組織內(nèi)阿米巴特異性引物序列及檢測結(jié)果圖示溶組織內(nèi)阿米巴引物擴增的目的基因16SrRNA基因溶組織內(nèi)阿米巴外引物amb-F3：GGCGCGTAAATTACCCAAamb-B3：GCGTTTTAATCACAACAACTT溶組織內(nèi)阿米巴內(nèi)引物amb-FIP：CCTTCAAGACATGCTTACGCACCAACAGATAGAAGAGGTAGTGACamb-BIP：GAGTAAGAAGCAAAGAGTCTTACGATTGGAGCTGGAATTACCG溶組織內(nèi)阿米巴環(huán)引物LB:AATCAATTGGAGGGCAAGTCTG試劑無Rnase去離子水的配制去離子水加入0.1％的DEPC（焦碳酸二乙酯）混合均勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。糞便基因組DNA試劑盒用于糞便基因組DNA的提取試劑（XX康為世紀生物科技有限公司提供），或其他等效產(chǎn)品。Loopamp?擴增反應(yīng)試劑盒Loopamp?擴增反應(yīng)試劑（榮研生物科技（中國）有限公司提供），或其他等效產(chǎn)品。陽性對照用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化λ噬菌體DNA后，取其片段（6.557bp）重組入質(zhì)粒所得。陰性對照陰性對照使用滅菌去離子水。操作程序待檢樣品DNA提取將糞便樣本稱取100mg～300mg至2mL離心管中，按糞便基因組DNA提取說明書提取模板DNA，獲得50μLDNA。所提取的模板DNA，直接放入PCR管中進行后續(xù)反應(yīng)或置-20℃保存?zhèn)溆谩AMP樣品反應(yīng)體系配制LAMP樣品反應(yīng)體系2×反應(yīng)緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLamb-F35pmolamb-B35pmolLB20pmolamb-FIP40pmolamb-BIP40pmol去離子水（DW）補足23μL。分裝后，放入微量離心機中離心數(shù)秒（瞬時離心），以此作為預(yù)混溶液，配制好的預(yù)混溶液立即使用。對照反應(yīng)體系2×反應(yīng)緩沖液12.5μL引物溶液DNA2.5μLBstDNA聚合酶1μL去離子水（DW）補足23μL。預(yù)混溶液與樣本溶液混合添加樣本溶液（溶組織內(nèi)阿米巴DNA）2μL，使總量達到25μL，對照反應(yīng)中，陰性對照使用去離子水2μL，陽性對照使用陽性對照DNA2μL，合上蓋子輕擊使溶液充分混勻后瞬時離心。上機檢測將已配制好、分裝完畢的反應(yīng)試管置于實時濁度儀（LA-320C，日本榮研公司）密閉進行，濁度儀實時監(jiān)控擴增情況，反應(yīng)程序為63℃保持60min，之后85℃滅活5min。結(jié)果判定實時濁度儀實時監(jiān)測反應(yīng)擴增情況，儀器通過讀取反應(yīng)管的濁度值繪制濁度曲線，在陰陽性對照成立的情況下，樣品反應(yīng)管出現(xiàn)濁度上升曲線的為陽性結(jié)果，沒有出現(xiàn)濁度上升曲線的為陰性結(jié)果（見圖B.1）LAMP檢測結(jié)果圖示LAMP檢測結(jié)果見圖B.1。圖B.1腸道溶組織內(nèi)阿米巴LAMP檢測結(jié)果圖

（規(guī)范性）

常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定表C.1給出了常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定。常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定寄生蟲病名稱選擇的藥物名稱制劑用法與用量吸蟲病絳蟲病吡喹酮praziquantelum片劑內(nèi)服，一次量，（5～10）mg/kg體重丙硫苯咪唑albendazole片劑內(nèi)服，一次量，（3～5）mg/kg體重線蟲病伊維菌素ivermectin片劑內(nèi)服，一次量，0.2mg/kg體重注射液皮下注射，一次量，0.2mg/kg體重丙硫苯咪唑albendazole片劑內(nèi)服，一次量，（3～5）mg/kg體重溶組織內(nèi)阿米巴病結(jié)腸小袋纖毛蟲病瘧原蟲病甲硝噠唑metronidazole片劑內(nèi)服，一次量，（25～35）mg/kg體重。連用5～10d?；虬凑照f明書使用氯喹vioform片劑內(nèi)服，一次量，5mg/kg體重，連用14d?；虬凑照f明書使用青蒿素（artemisinin）中藥方制內(nèi)服，一次量，（5～10）g，連用（5～10）d。或按照說明書使用球蟲病隱孢子蟲病氨丙啉amprolium粉劑內(nèi)服，一次量，（10～20）mg/kg體重，連用（5～10）d。或按照說明書使用艾草wormwood中藥方制內(nèi)服，一次量，（5～10）g，連用（5～10）d?；虬凑照f明書使用螨蟲病虱病伊維菌素ivermectin片劑內(nèi)服，一次量，0.2mg/kg體重注射液皮下注射，一次量，0.2mg/kg體重溴氰菊酯decamethrin溶液藥浴、噴淋，（5～8）mg/L二嗪農(nóng)dimpylate溶液藥浴，初浴濃度為100mg/L，補充液濃度為300mg/L解毒藥阿托品atropine注射液皮下注射，中度中毒，每次（0.5～1）mg，隔（30～60）min1次；對嚴重中毒，每次靜注（1～2）mg，隔（15～30）min一次，至病情穩(wěn)定后，逐漸減量。消毒藥石灰Calx粉劑配成10％～20％乳劑噴灑或者干撒二氧化氯ChlorineDioxide片劑噴灑，配成（20～50）mg/L水溶液

（規(guī)范性）

操作規(guī)范檢測過程中防止交叉污染的措施采樣和制樣過程采樣和制樣工具，應(yīng)清洗干凈，121℃，15min～20min滅菌，一套清潔工具僅限于一個樣品使用。存放樣品的容器應(yīng)該經(jīng)過清洗、滅菌，或為滅菌一次性容器。檢測過程PCR實驗室應(yīng)分出試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)、產(chǎn)物擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。將模板提取、LAMP反應(yīng)液配制、LAMP擴增及鑒定等步驟分