《快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法》

ICS11.120.10

CCSC10

CI

中國(guó)國(guó)際科技促進(jìn)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CIXXXX—2023

快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法

Amethodforrapidmonitoringofduloxetinebloodconcentration

（征求意見(jiàn)稿）

在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實(shí)施

中國(guó)國(guó)際科技促進(jìn)會(huì)??發(fā)布

T/CIXXXX—2023

快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法

1范圍

本文件提供了快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法，該方法采用二維色譜儀系統(tǒng)，包括制備溶液、設(shè)

置色譜參數(shù)、實(shí)施檢測(cè)以及計(jì)算含量。

本文件適用于快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4技術(shù)方案

一種快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法，采用二維液相色譜儀系統(tǒng)，二維液相色譜儀系統(tǒng)為PM3000

系統(tǒng)，包括帶在線脫氣單元的雙三元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、輔助泵、帶有一個(gè)六通閥的柱溫箱和檢測(cè)器

DAD。

制備溶液

制備溶液的方法比較靈活，在這里不做限定。

蛋白沉淀劑為硫酸鋅溶液溶液和乙腈的混合物，其中硫酸鋅純度不低于98%，可市售獲得。硫酸鋅

溶液的質(zhì)量濃度為3%~5%,硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：（1~10）。

4.1.1空白血漿溶液

取正常人空白血漿2mL，加入蛋白沉淀劑稀釋定容至10mL，混合后超聲5min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至

EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，得到的濾液

作為空白血漿溶液。

4.1.2系統(tǒng)適用性溶液

取鹽酸度洛西汀對(duì)照品51.64mg（相當(dāng)于度洛西汀46mg），精密稱定，加入甲醇溶解，定容至100

mL，得到濃度為0.46mg/mL的度洛西汀儲(chǔ)備液；精密量取度洛西汀儲(chǔ)備液1mL至10mL的容量瓶中，用

甲醇稀釋定容，得到濃度為46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10μL46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液于

10mL的容量瓶中，加入空白血漿2mL，加入蛋白沉淀劑稀釋定容至10mL，混合后超聲5min，得到每1

mL中含46ng的度洛西汀溶液，將上述溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心10min，取其上

清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，得到的濾液作為系統(tǒng)適用性溶液。

4.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液

將上述46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋500倍，得92ng/mL的線性儲(chǔ)備液，采用倍比稀釋法逐級(jí)

稀釋得到不同濃度的度洛西汀工作溶液，分別精密量取上述度洛西汀線性儲(chǔ)備液各5mL至10mL、4mL

至10mL、3mL至10mL、2mL至10mL、2.5mL至50mL容量瓶中，每個(gè)瓶中加入空白血漿2mL，加入

蛋白沉淀劑稀釋定容，混合后超聲5min，將上述溶液分別轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心

10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，分別得到濃度為46ng/mL、36.8ng/mL、27.6ng/mL、

18.4ng/mL、4.6ng/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按照上述46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法，另外

配制一份27.6ng/mL的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為含量測(cè)定溶液，用來(lái)按照外標(biāo)法計(jì)算樣品中度洛西汀的

濃度。

1

T/CIXXXX—2023

4.1.4供試品溶液

取正在進(jìn)行鹽酸度洛西汀治療的患者的人體血漿2mL至10mL的容量瓶中，加入蛋白沉淀劑混勻并

稀釋定容，混合后超聲5min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心10min，取其上

清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，得到的濾液作為供試品溶液。

設(shè)置色譜參數(shù)

在二維液相色譜儀系統(tǒng)系統(tǒng)上設(shè)置一維柱色譜條件的參數(shù)、二維柱色譜條件的參數(shù)和大體積進(jìn)樣條

件的參數(shù)和閥切換條件的參數(shù)，并使用空白血漿溶液和系統(tǒng)適用性溶液確認(rèn)，待二維液相色譜儀系統(tǒng)系

統(tǒng)的壓力和基線平衡穩(wěn)定后，注入不少于5針空白血漿溶液和系統(tǒng)適用性溶液用來(lái)確認(rèn)。

實(shí)驗(yàn)用的二維液相色譜儀系統(tǒng)為PM3000系統(tǒng)，包括帶在線脫氣單元的雙三元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、

輔助泵、帶有一個(gè)六通閥的柱溫箱和檢測(cè)器，上述雙三元梯度泵包括一維泵和二維泵，一維泵用于在線

固相萃取，二維泵用于色譜分析，吸附在一維柱的度洛西汀通過(guò)六通閥切換到分析流路中，可以將原來(lái)

用4~5h進(jìn)行固相萃取前處理的樣品縮短至3min左右在線完成，凈化和濃縮后的度洛西汀樣品直接進(jìn)行定

量分析。上述六通閥設(shè)置的閥口位置順序?yàn)殚y1、閥2、閥3、閥4、閥5和閥6。

如圖1，一維柱色譜條件和二維柱色譜條件通過(guò)閥切換技術(shù)的系統(tǒng)配合的工作原理如下：

a)一維洗脫液通過(guò)一維泵由閥2接口進(jìn)入，閥2接口切換經(jīng)閥1接口，經(jīng)與閥1和閥4通過(guò)管

線相連的一維柱實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的富集濃縮，多余的一維洗脫液，由閥4接口切換經(jīng)閥3接口至

閥3接口經(jīng)管線排出；

b)富集的餾分待測(cè)物由閥4接口切換經(jīng)閥5接口，二維洗脫液通過(guò)二維泵由閥6接口進(jìn)入，閥6

接口切換經(jīng)閥1接口，使得一維柱以正向模式與二維柱串聯(lián)，乙腈-0.05mmol磷酸二氫鉀

（PH=6.0）緩沖液作為洗脫液將餾分待測(cè)物從一維柱上洗脫下來(lái)，經(jīng)管線由閥5接口進(jìn)入二

維柱進(jìn)行進(jìn)一步分離，分離的待測(cè)物經(jīng)所述檢測(cè)器檢測(cè)后由管線排出，檢測(cè)器通過(guò)信號(hào)傳輸

轉(zhuǎn)化在計(jì)算機(jī)上顯示出相應(yīng)的色譜圖。

圖1

在上述PM3000系統(tǒng)中的自動(dòng)進(jìn)樣器的最大進(jìn)樣體積為1000μL，可以連續(xù)進(jìn)樣富集待測(cè)物質(zhì)，通常

對(duì)于一維HPLC而言進(jìn)樣體積過(guò)大會(huì)嚴(yán)重導(dǎo)致色譜峰擴(kuò)展而影響分離度進(jìn)而降低靈敏度，設(shè)計(jì)了通過(guò)大體

積進(jìn)樣來(lái)提高本方法的靈敏度。

大體積的樣品先流經(jīng)一維柱富集在柱頂端，然后再經(jīng)過(guò)一維洗脫液洗脫血漿樣品中的大分子蛋白成

分和其他雜質(zhì)，通過(guò)正向切閥流入到二維柱中進(jìn)行分離和定量分析。由于樣品溶劑中含有高比例的有機(jī)

2

T/CIXXXX—2023

溶劑，所以用了大體積泵進(jìn)水稀釋，確保被測(cè)物質(zhì)在一維柱上富集不流出，由于進(jìn)樣體積較大，容易導(dǎo)

致色譜峰擴(kuò)展及變形，采用一維柱富集純化后洗脫液正方向切閥，進(jìn)行洗脫后再流經(jīng)至二維柱，并設(shè)計(jì)

了輔助泵在一維柱富集純化期間注入純化水，使一維柱中的待測(cè)成分充分保留，這樣就可實(shí)現(xiàn)大體積進(jìn)

樣也不會(huì)使色譜峰峰型變寬。而且，輔助泵注入純水的程序?yàn)椋?-3min，流速為1.2mL/min；3-3.1min，

流速由1.2mL/min改變?yōu)?.1mL/min；3.1-14.5min，流速為0.1mL/min；14.5-14.8min，流速由0.1

mL/min改變?yōu)?.2mL/min；14.8-15.0min，流速為1.2mL/min。

為了能夠在短時(shí)間（3分鐘內(nèi)）純化富集血漿中的有效成分，對(duì)一維柱的填充劑材料基質(zhì)要求有很

好的親水性，因?yàn)檠獫{中含有血細(xì)胞和大分子的蛋白，這就需要色譜純化分離有分子排阻和色譜分配兩

種模式同時(shí)存在，并結(jié)合度洛西汀與填充劑材料的相互作用，在本實(shí)施例中，具體的一維柱為NNJW16851

Cat.No.12439MFPh-1S-5固相萃取柱，規(guī)格為4.0mml.D.×20mm，針對(duì)度洛西汀的化合物結(jié)構(gòu)，對(duì)二

維柱的填充劑材料基質(zhì)的表面要求有很好的親水性，二維柱的雙封端技術(shù)優(yōu)良，依據(jù)度洛西汀在二維柱

中的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，使得度洛西汀具有較好的分離度，可以選擇填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠

的色譜柱，具體的二維柱為Unisil3-120C18UltraQCS180425色譜柱，規(guī)格為SS4.6mm×100mm，其填

料中硅醇基活性極低，該色譜柱具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和耐用性，使用壽命達(dá)1000針次以上。

進(jìn)一步的，在二維液相色譜儀系統(tǒng)上設(shè)置的色譜參數(shù)應(yīng)符合表1。

表1色譜參數(shù)

儀器PM3000系統(tǒng)為一體機(jī)其中包括：泵、輔助泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測(cè)器DAD

檢測(cè)器DAD檢測(cè)器

檢測(cè)波長(zhǎng)290nm

一維柱NNJW16851Cat.No.12439MFPh-1S-5（4.0mml.D.×20mm）

二維柱Unisil3-120C18UltraQCS180425色譜柱（SS4.6mm×100mm）

一維洗脫液一維流動(dòng)相A：甲醇；一維流動(dòng)相B：水

二維洗脫液二維流動(dòng)相A：乙腈；二維流動(dòng)相B：0.05mmol磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)PH=6.0

時(shí)間/min流速/mL·min-1A%B%

00.51090

6.50.51090

7.01.58020

一維洗脫方式：梯度洗脫程序9.01.58020

9.21.51090

11.01.51090

11.50.51090

15.00.51090

時(shí)間/min流速/mL·min-1A%B%

01.0005149

二維洗脫方式：等度洗脫程序

151.0005149

NOTimeValveleft

10.11-2

閥切換程序

23.01-6

36.51-2

柱溫30℃

進(jìn)樣量1000μl

為了核實(shí)二維液相色譜儀系統(tǒng)具有良好的分離度和精確度，以勝任將要實(shí)施的檢測(cè)工作，在進(jìn)樣空

白血漿溶液后，重復(fù)進(jìn)樣系統(tǒng)適用性溶液并將所測(cè)結(jié)果與本文件中的要求進(jìn)行比較，如果符合，后續(xù)的

供試品檢測(cè)分析則可以繼續(xù)進(jìn)行。在本實(shí)施例中，對(duì)系統(tǒng)適用性溶液的要求為空白血漿溶液的色譜圖中

不能有度洛西汀峰的干擾峰，系統(tǒng)適用性溶液中的度洛西汀色譜峰與其他物質(zhì)色譜峰的分離度不小于

1.5，度洛西汀峰純度閾值不小于0.990，重復(fù)進(jìn)樣5針度洛西汀峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)不得過(guò)

1%。

實(shí)施檢測(cè)

3

T/CIXXXX—2023

4.6ng/mL、18.4ng/mL、27.6ng/mL、36.8ng/mL、46.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和供試品溶液分

別注入所述二維液相色譜儀，各進(jìn)樣1針，記錄色譜圖時(shí)間15分鐘。

計(jì)算含量

分析得到所有標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液對(duì)應(yīng)的度洛西汀的峰面積，將上述結(jié)果通過(guò)加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回

歸，得到度洛西汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=ax+b，其中，y為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液對(duì)應(yīng)的度洛西汀的

峰面積，x為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中度洛西汀的濃度，得到的線性方程為：y=0.063x-0.0099，線性相關(guān)系數(shù)

r=0.9999。

在上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，按外標(biāo)法計(jì)算得到供試品溶液中度洛西汀的含量。

計(jì)算公式為：

血漿樣品中度洛西汀的濃度=供試品中度洛西汀的峰面積*度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)品濃度*稀釋倍數(shù)/度洛西

汀標(biāo)準(zhǔn)品峰面積。

考察了不同配比、不同濃度硫酸鋅溶液的蛋白質(zhì)沉淀劑對(duì)方法檢測(cè)結(jié)果的影響：

a)試驗(yàn)組1，0.3%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

b)試驗(yàn)組2，0.4%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

c)試驗(yàn)組3，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

d)試驗(yàn)組4，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：1；

e)試驗(yàn)組5，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

f)試驗(yàn)組6，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：4；

g)試驗(yàn)組7，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：6；

h)試驗(yàn)組8，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：8；

i)對(duì)比例1，0.2%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

j)對(duì)比例2，0.6%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；

k)對(duì)比例3，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為2：1；

l)對(duì)比例4，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：11；

m)對(duì)比例5，乙腈1000μL；考察回收率，結(jié)果應(yīng)符合表2。

表2不同配比的蛋白沉淀劑對(duì)方法回收率的影響

項(xiàng)目試驗(yàn)組1試驗(yàn)組2試驗(yàn)組3試驗(yàn)組4試驗(yàn)組5

回收率96.9%97.3%97.8%104.7%95.6%

項(xiàng)目試驗(yàn)組6試驗(yàn)組7試驗(yàn)組8對(duì)比例1對(duì)比例2

回收率100.5%99.3%103.2%95.1%95.5%

項(xiàng)目對(duì)比例3對(duì)比例4對(duì)比例5

回收率92.9%94.3%93.4%

由表2可知，試驗(yàn)組1～試驗(yàn)組8提供的蛋白沉淀劑可保證本發(fā)明的方法回收率在95%～105%之間，采

用0.5%的硫酸鋅溶液，與乙腈的體積比在1：4～1：6范圍內(nèi)時(shí)，可保證本發(fā)明的方法回收率在98%～102%

之間。

考察了超聲時(shí)間對(duì)方法回收率的影響，超聲時(shí)間不能少于3min，在超聲的作用下，硫酸鋅水溶液

的溶劑化作用更有利于血漿中度洛西汀的提取，乙腈可以更好的輔助將蛋白沉淀下來(lái)，時(shí)間過(guò)短不利于

度洛西汀的提取，導(dǎo)致方法回收率偏低，不準(zhǔn)確，為了獲得準(zhǔn)確度更高和操作方便，選擇超聲時(shí)間5min。

如圖2-3所示，系統(tǒng)適用性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為空白血漿溶液的色譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)度洛西汀干擾峰，

系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖中與度洛西汀峰最近的雜質(zhì)峰的分離度為2.0，大于1.5，符合本方法的要求，

從而驗(yàn)證了本方法專屬性強(qiáng)。