微生物檢驗(yàn)技能-細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)

擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)知道藥敏試驗(yàn)的概念、用途和意義會(huì)依據(jù)細(xì)菌選擇相應(yīng)的抗生素會(huì)正確進(jìn)行擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)會(huì)使用麥?zhǔn)媳葷峁苷_配制適當(dāng)濃度的菌液會(huì)正確使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑能準(zhǔn)確判斷擴(kuò)散法藥敏結(jié)果藥敏試驗(yàn)的概念

抗微生物藥物敏感試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)，是對(duì)敏感性不能預(yù)測(cè)的臨床分離株細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)的試驗(yàn)。主要用以指導(dǎo)臨床選擇治療藥物；若對(duì)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)點(diǎn)反饋來(lái)的藥敏數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，還具有監(jiān)測(cè)和發(fā)現(xiàn)某細(xì)菌耐藥性變異趨勢(shì)的意義。常用方法有:紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauertest）稀釋法（dilutiontest）E試驗(yàn)法（Etest）殺菌試驗(yàn)體外聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)K-B法藥敏試驗(yàn)原理將含有抗菌藥物的紙片貼在已接種待測(cè)細(xì)菌的平板相應(yīng)位置上，藥物向瓊脂中擴(kuò)散，形成以紙片為中心的藥物濃度梯度分布區(qū)，在一定位置上的藥物高于抑菌濃度時(shí)，細(xì)菌不生長(zhǎng)而形成透明抑菌圈，抑菌圈越大，細(xì)菌對(duì)該藥物越敏感。常用培養(yǎng)基

MH瓊脂；90mm平皿；4mm厚度抗菌藥物紙片6.35mm，吸水20μl。（一般用商品紙片）菌液用生理鹽水或營(yíng)養(yǎng)肉湯取純培養(yǎng)的菌落制備成濁度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液。方法將0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)的菌液涂布接種于MH瓊脂表面，按紙片間距24mm和邊距15mm的標(biāo)準(zhǔn)，加貼相應(yīng)藥敏紙片，35℃培養(yǎng)16-18h，判定結(jié)果。操作方法1.將約56℃恒溫的無(wú)菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm的平板，其厚度4mm。2.無(wú)菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個(gè)菌落。操作方法操作方法3.置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于McFarlandNo0.5管。操作方法4.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。操作方法操作方法5.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3~10min后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。操作方法6.根據(jù)選擇的菌株挑選相應(yīng)的抗菌紙片。抗生素的選擇葡萄球菌屬：

青霉素（PEN)苯唑西林（OXA）萬(wàn)古霉素（VAN)替考啦寧（TET)慶大霉素（GEN)紅霉素（ERY)四環(huán)素（TET)環(huán)丙沙星（CIP）克林霉素（CM）復(fù)方新諾明（SXT)氯霉素（CHL)腸桿菌科細(xì)菌哌拉西林(PIP)頭孢他啶(CAZ)頭孢吡肟(FEP)頭孢噻肟(CTX)頭孢曲松(CRO)亞胺陪南(IMP)胺曲南(AZT)慶大霉素(GEN)阿米卡星(AMK)四環(huán)素(TET)環(huán)丙沙星(CIP)左氧氟沙星(LVF)加替沙星(GTF)氯霉素(CHL)復(fù)方新諾明(SXT)氨卞西林(AMP)奧格門(mén)汀(AVG）頭孢唑啉(CFZ)萘啶酸(NAL)頭孢呋肟(CXM)抗生素的選擇腸球菌屬細(xì)菌青霉素(PEN) 氨卞西林(AMP)萬(wàn)古霉素(VAN)替考啦林(TEL)

紅霉素(ERY)四環(huán)素(TET)

環(huán)丙沙星(CIP)呋喃妥因(FD)

高濃度慶大(GEH)高濃度鏈霉素(STH)抗生素的選擇操作方法7.用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。操作方法8.經(jīng)過(guò)35℃16～24h孵育。9.取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI（clinicalandlaboratorystandardsinstitute）標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感(susceptible,S)、耐藥(resistant,R)、中介(intermediate,I)。操作方法MH瓊脂巧克力MH血MH結(jié)果判定：敏感；中介；耐藥結(jié)果判定其他藥敏試驗(yàn)D試驗(yàn)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）測(cè)定單紙片擴(kuò)散法（初篩試驗(yàn)）將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基上貼頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、頭孢泊肟(Cefprozil,CPD)紙片，置35℃過(guò)夜培養(yǎng)，若抑菌環(huán)直徑CAZ≤22mm、CTX≤27mm、CRO≤25mm、ATM≤27mm、CPD≤22mm時(shí)可疑為產(chǎn)ESBLs菌株。單紙片擴(kuò)散法（初篩試驗(yàn)）產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）測(cè)定雙紙片協(xié)同法（初篩試驗(yàn)）將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，把含10μg/片克拉維酸紙片（ClavulanicAcid，CLA）貼于MH平板中央，于克拉維酸紙片周圍分別貼上頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、氨曲南、頭孢泊肟紙片（紙片中心距離為20～24mm），置35℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察有無(wú)協(xié)同現(xiàn)象，CLA與任何一種ESC（超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素）有協(xié)同現(xiàn)象者可疑為產(chǎn)ESBL菌株。CLA是克拉維酸，為酶抑制劑，可以抑制ESBL的活性，因此，紙片間會(huì)出現(xiàn)協(xié)同作用！ESBL初篩試驗(yàn)結(jié)果ESBL初篩試驗(yàn)結(jié)果ESBL確證試驗(yàn)雙紙片增效法（確認(rèn)試驗(yàn)）將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基上分別貼頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢曲松/克拉維酸、氨曲南/克拉維酸、頭孢泊肟/克拉維酸紙片，置35℃過(guò)夜培養(yǎng)后量取抑菌環(huán)直徑，與單紙片平皿對(duì)照，若加克拉維酸紙片較未加克拉維酸紙片抑菌環(huán)直徑≥5mm，即為ESBL陽(yáng)性。ESBL確證試驗(yàn)ESBL確證試驗(yàn)ESBL確證試驗(yàn)ESBL確證試驗(yàn)β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定試驗(yàn)陽(yáng)性頭孢哨噻吩濾紙片10分鐘內(nèi)由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色即陽(yáng)性結(jié)果，示產(chǎn)色頭孢菌素的β－內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開(kāi)。說(shuō)出K-B法實(shí)驗(yàn)原理說(shuō)出藥敏試驗(yàn)用MH平板制作標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)出K-B法用紙片標(biāo)準(zhǔn)怎樣選擇革蘭陽(yáng)性球菌藥敏用抗生素怎樣選擇革蘭陰性桿菌藥敏用抗生素怎樣使用有標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)稀釋法藥敏試驗(yàn)知道MIC的含義會(huì)正確稀釋抗菌藥物會(huì)配制試驗(yàn)用濃度菌液會(huì)稀釋法藥敏試驗(yàn)操作會(huì)正確判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果知道如何進(jìn)行稀釋法藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制稀釋法藥敏試驗(yàn)的目的稀釋法藥敏試驗(yàn)是體外定量測(cè)定抗菌藥物的抑菌活性的方法。有液體稀釋法和固體培養(yǎng)基稀釋法兩種方法。稀釋法測(cè)定的某抗菌藥物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)液體稀釋法原理：

以水解酪蛋白（M-H）液體培養(yǎng)基將藥品進(jìn)行不同濃度的稀釋，然后接種待檢菌，定量測(cè)定抗菌藥物抑制或殺死待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）或最低殺菌濃度（MBC）。材料：

1、配制抗菌藥物原液

2、M-H液體培養(yǎng)基

3、接種菌液（0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)再稀釋200倍）

方法：（1）排列10-15支試管，從第2管起，每管加入M-H液體培養(yǎng)基1ml。（2）吸取抗菌藥物原液（1000μg/ml）5.12ml、M-H液體培養(yǎng)基4.88ml于第1管中混勻，取出1ml加入第2管混勻，從第2管取1ml加入第3管混勻，依次倍比稀釋至第15管。（3）加入待檢菌懸液每管0.05ml混勻。置35℃培養(yǎng)12~18h后觀察結(jié)果。同法做對(duì)照菌藥敏試驗(yàn)。

操作方法操作方法操作方法操作方法微量液體稀釋法(microdilutiontest)原理：聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入100μl濃度為105CFU/ml的菌液，蓋上蓋板，35℃16～20h觀察結(jié)果?？椎撞壳逦怀霈F(xiàn)細(xì)菌沉淀的最低抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度，通過(guò)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感和耐藥。再取0.01ml容量接種環(huán)取肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的液體接種于血瓊脂平板作次代培養(yǎng)，經(jīng)35℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死99.9％原始種入的細(xì)菌即為該菌的最低殺菌濃度(MBC)。操作方法1.抗菌藥物的稀釋和融解2.抗菌藥物母液的稀釋操作方法3.在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素100μl，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管。操作方法操作方法4.挑選18~24小時(shí)的菌落置M-H肉湯增菌4~6小時(shí)。操作方法5.制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，然?:200稀釋，使之最終濃度10的5次方CFU/ml。操作方法6.用微量加樣器接種100μl到96孔中，蓋上蓋板。同時(shí)作陽(yáng)性、陰性對(duì)照。7.手工看濁度或儀器自動(dòng)判讀。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告細(xì)菌對(duì)某抗菌藥物為敏感、耐藥和中介。操作方法結(jié)果判斷：

MIC：肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)管的藥物濃度。

MBC：用0.01ml定量接種環(huán)從肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)管中取一環(huán)材料，接種到血平板上，35℃培養(yǎng)過(guò)夜后觀察結(jié)果，99%的原始接種細(xì)菌被殺死的材料管藥物濃度為最小殺菌濃度。結(jié)果判斷瓊脂稀釋法原理：將待測(cè)菌接種到含有不同濃度藥物的瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度（MIC）。材料：（1）抗菌藥物原液（2）M-H培養(yǎng)基（分裝試管中13.5ml）（3）含藥瓊脂（用前配制）各種抗菌藥物的稀釋方法抗菌藥物原液μg或u/ml原液量(ml)加蒸餾水量(ml)藥物稀釋濃度μg或u/ml1：9瓊脂中含藥物濃度μg或u/ml20006.43.612801281280226406412801332032128017160461602280816013404160172022022101201350.520172.50.25方法：將一組含不同濃度的藥物平板和一個(gè)不含藥物的空白對(duì)照平板分別用筆畫(huà)出12個(gè)放射狀小格或方格，并編號(hào)。每格點(diǎn)種一種待檢菌，故可同時(shí)測(cè)12個(gè)菌株的MIC。待檢菌濃度