微生物檢驗技術(shù)-細菌檢驗技術(shù)

細菌的人工培養(yǎng)一、無菌操作技術(shù)二、接種方法(一)接種針和接種環(huán)取細菌的用具。(二)無菌室提供無菌環(huán)境。二、無菌技術(shù)1.無菌室使用前的消毒：打開紫外燈照射30min-1小時，或用5%的石炭酸噴霧消毒。2.所用物品均應(yīng)在使用前嚴格滅菌。使用時不得觸摸、碰撞未經(jīng)滅菌的物品。3.無菌的試管、瓶子打開后應(yīng)在火焰上通過2-3次，盡快蓋好，或盡量靠近火焰；管、瓶口切忌朝上暴露于空氣下。4.接種環(huán)、針，每次使用前、后都要在火焰上燒灼滅菌。

5.進行培養(yǎng)基的分裝、細菌接種都要在生物安全柜中進行，注意生物安全，防止污染。6.無菌吸管頭上應(yīng)塞有棉花，不用口吹或吸液體。7.實驗室的所有感染性物品未經(jīng)消毒滅菌不能拿出實驗室，應(yīng)經(jīng)消毒處理。8.操作者要注意個人防護，穿好工作服，必要時戴好帽子、口罩、手套等，離開時要更衣、消毒、洗手。9.桌面、操作臺需及時用消毒液擦干凈。(三)接種與分離技術(shù)1.平板劃線法：⑴分區(qū)劃線法(二)連續(xù)劃線法2.斜面接種法3.半固體接種法4.液體接種5.傾注法7涂布接種法三、細菌的培養(yǎng)方法1.普通培養(yǎng)法2.CO2培養(yǎng)法3.微需氧培養(yǎng)法4.厭氧培養(yǎng)法四、細菌的生長現(xiàn)象(一)菌落(二)細菌在液體中的生長現(xiàn)象1.均勻混濁2.沉淀生長3.表面生長(三)細菌在半固體中的生長現(xiàn)象沿穿刺線生長。穿刺線兩側(cè)云霧狀混濁。細菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力現(xiàn)象無動力現(xiàn)象鑒定細菌的其它試驗原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎全敏感，而其他鏈球菌則耐藥。培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏0.04U/片結(jié)果：＞10mm敏感；＜10mm耐藥意義：A群鏈球菌敏感1.桿菌肽試驗2.O/129試驗原理：O/129（二氨基喋啶）對弧菌屬有抑制作用，而對氣單胞菌屬無抑制作用培養(yǎng)基；堿性瓊脂培養(yǎng)基方法：紙片法藥敏40ug/片結(jié)果：有抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥意義：弧菌、鄰單胞菌敏感；氣單胞菌屬耐藥3.奧普托欣(Optochin)試驗原理：肺炎鏈球菌對Optochin敏感，其他鏈球菌無抑制作用培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏5ug/片結(jié)果：抑菌環(huán)直徑＞14mm敏感；＜14mm耐藥，此時加做膽汁溶菌試驗證實意義：肺炎鏈球菌對Optochin敏感4.新生霉素敏感試驗原理：表皮葡萄球菌對新生霉素敏感；腐生葡萄球菌對新生霉素耐藥培養(yǎng)基：MH瓊脂方法：同紙片法藥敏5ug/片結(jié)果：抑菌環(huán)直徑＞16mm敏感；≤16mm耐藥意義：區(qū)別表皮葡萄球菌與腐生葡萄球菌5.溶血試驗?zāi)承┘毦诖x過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，不同的細菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細菌。（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。（2）β（乙型）溶血:

菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。（3）γ（-丙型）溶血:

菌落周圍無溶血環(huán)。甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血甲型溶血性鏈球菌（草綠色鏈球菌）丙型鏈球菌乙型溶血性鏈球菌6.膽汁溶菌酶試驗原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，使細菌發(fā)生自溶試劑：10%去氧膽酸鈉或純牛膽汁方法：平板法：滴加10%去氧膽酸鈉一環(huán)于被測菌落上35℃30min觀察結(jié)果。試管法：0.9ml被測菌培養(yǎng)物加入10%去氧膽酸鈉0.1ml后置35℃水浴10-30min觀察結(jié)果

結(jié)果：菌落消失，或培養(yǎng)物變透明為陽性

意義：肺炎鏈球菌陽性7.氫氧化鉀拉絲試驗

(1)原理：G-細菌的細胞壁在稀堿溶液中易于破裂，釋放出未斷裂的DNA螺旋，菌懸液呈現(xiàn)粘性，可用接種環(huán)攪拌后拉出粘絲來.(2)方法：取1滴40g/L氫氧化鉀水溶液（應(yīng)新鮮配制）于潔凈玻片上，取新鮮菌落少許與其攪拌混勻，觀察能否拉出粘絲。(3)結(jié)果：拉出粘絲者為陽性。(4)應(yīng)用：主要用于革蘭陰性菌與易脫色的革蘭陽性菌的鑒別。大多數(shù)革蘭陰性菌于5-10s內(nèi)出現(xiàn)陽性反應(yīng)。反應(yīng)慢者大多數(shù)菌株在60s內(nèi)出現(xiàn)陽性，而革蘭陽性菌在60s以后仍為陰性。

8.免疫學(xué)鑒定免疫學(xué)反應(yīng)：指相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，所出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。

9.毒力鑒定：內(nèi)毒素、外毒素

一、內(nèi)毒素測定：鱟試驗法二、外毒素試驗：動物實驗10.分子生物學(xué)檢測一、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR)

實驗原理聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。在待擴增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。

定義

兩條來源不同，但具有互補序列的核酸，按堿基配對原則復(fù)性形成一個雜交體，這個過程即雜交，或稱分子雜交。分類

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA二、核酸雜交(Hybridization)三、生物芯片技術(shù)生物芯片（biochip）的概念指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。細菌形態(tài)學(xué)檢查

一、實驗室規(guī)則及注意事項不得在實驗工作區(qū)內(nèi)吃、喝以及裝卸隱形眼鏡等。實驗用的冰箱中不得儲存飲料、食物。在實驗操作時請穿好實驗防護衣及其它合適的防護服。實驗室中不宜穿涼鞋、露趾鞋。操作感染性、有毒物質(zhì)或動物時，必須戴手套。不宜將實驗衣、手套或其它個人防護裝備穿著到實驗室以外的場所。實驗工作臺應(yīng)每日清理，若有污染發(fā)生應(yīng)立即進行消毒；所有設(shè)備在使用后均必須及時清理和處理，以保持無污染狀態(tài)。所有污染物－玻璃器皿、動物籠、實驗裝置等，必須先經(jīng)過消毒處理(如：高壓蒸氣滅菌或化學(xué)殺菌處理)，再行清洗或重復(fù)使用。廢棄物需經(jīng)適當之廢棄物處理流程處置。在接觸傳染性物質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)和動物后脫掉手套，切記洗手。嚴格無菌操作，樹立良好無菌觀念。在遇到不能處理的問題時，請立即與本實驗室人員聯(lián)系以便及時采取相應(yīng)的處理或消毒措施。

顯微鏡的使用

微生物的基本特點：?。?/p>

決定了顯微技術(shù)是進行微生物研究的另一項重要技術(shù)，因為絕大多數(shù)微生物的個體形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)只能通過顯微鏡才能進行觀察和研究。1.普通光學(xué)顯微鏡用油鏡放大1000倍，一般細菌均能清楚看到。2.暗視野顯微鏡用于檢查不染色的活細菌和螺旋體的形態(tài)及運動觀察。3.相差顯微鏡4.熒光顯微鏡5.電子顯微鏡

細菌特殊染色負染色法細菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)

構(gòu)觀察

細菌基本形態(tài)－球菌細菌基本形態(tài)－桿菌細菌基本形態(tài)－弧菌細菌特殊結(jié)構(gòu)－芽胞細菌特殊結(jié)構(gòu)－莢膜細菌特殊結(jié)構(gòu)－鞭毛一、細菌染色標本的檢查細菌標本經(jīng)染色后，除能清楚看到細菌的形態(tài)、大小、排列方式外，還可根據(jù)染色反應(yīng)將細菌進行分類。（一）染色方法的種類1、單染法:采用一種染料染色2、復(fù)染法（鑒別染色）:采用兩種或兩種以上的不同染料進行先后染色，使不同種類的細菌、同種細菌的不同結(jié)構(gòu)，分別染上不同的顏色，以便鑒別細菌。（二）常用染料:苯環(huán)上帶有色基和助色基，色基為顏色，助色基解離后與被染物結(jié)合。1.堿性染料：美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅。2.酸性染料：伊紅、酸性復(fù)紅、剛果紅。3.中性染料：堿性染料和酸性染料的復(fù)合物，伊紅美藍、伊紅天青。（三）涂片制備涂片：干燥：固定：通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。涂片干燥固定染色水洗、吸干鏡檢制備涂片標本→染色(一)單染色法只用一種染料將細菌染成一種顏色，只能觀察細菌的形態(tài)、排列、大小。1.染液：呂氏美藍液或稀釋石炭酸復(fù)紅液。2.方法：細菌涂片干燥固定，滴加染液染色1min，水洗，吸干，鏡檢。3.結(jié)果：菌體呈藍色或紅色。（二）革蘭染色最經(jīng)典、最常用的染色方法。通過革蘭染色將所有細菌分為G+菌和G-菌兩大類。革蘭陰性菌（紅色）革蘭陽性菌（紫色）（三）抗酸染色法

抗酸染色結(jié)果（×1000）：紅色為抗酸桿菌，藍色為非抗酸桿菌抗酸染色用于區(qū)別抗酸菌與非抗酸菌（四）其他染色法

1.特殊結(jié)構(gòu)染色法（1）莢膜染色法莢膜染色結(jié)果，×1000