分枝桿菌屬、放線菌屬與諾卡菌屬的檢驗(yàn)（臨床微生物檢驗(yàn)課件）

放線菌和諾卡菌屬

細(xì)菌鑒定

學(xué)習(xí)目標(biāo)１掌握放線菌屬與諾卡菌屬的微生物學(xué)檢測要點(diǎn)２了解放線菌屬與諾卡菌屬微生物特性和臨床意義。3放線菌是多數(shù)不致病，對人類致病的主要有放線菌屬和諾卡菌屬。放線菌屬和諾卡菌屬概述4放線菌與諾卡菌的區(qū)別特征放線菌諾卡菌培養(yǎng)特性厭氧/微需氧、需氧35℃~37℃生長20℃

~25℃

、或37℃均生長20℃

~25℃不生長抗酸性非抗酸性絲狀菌弱抗酸性分布寄生口腔、上呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道存在外界環(huán)境如土壤、多為腐生菌感染性內(nèi)源性感染外源性感染代表菌種衣氏放線菌.etc星形諾卡菌、巴西諾卡菌放線菌屬和諾卡菌屬概述51．厭氧或微需氧菌:G+、非抗酸性絲狀菌2．不含分枝菌酸3．分布：人口腔、上呼吸道，等與外界相通的腔道，屬正常菌群；4．致病菌：衣氏放線菌（A.israelii）

(一)放線菌屬（Actinomyces）放線菌屬細(xì)菌鑒定6臨床意義正常菌群，條件致病，對人致病的主要是衣氏放線菌和牛型放線菌；慢性化膿性感染，常伴有多發(fā)性瘺管，排出黃色硫磺樣顆粒；與齲齒、牙周炎有關(guān)。放線菌屬細(xì)菌鑒定7微生物學(xué)檢驗(yàn)主要：硫磺樣顆粒（膿液、痰、分泌物）有顆粒：壓片鏡檢：菊花狀排列的菌絲必要：厭氧培養(yǎng)（緩慢、37℃培養(yǎng)2周以上）放線菌屬細(xì)菌鑒定8微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本采集：注意查找有無“硫磺顆?！狈啪€菌屬細(xì)菌鑒定9硫磺樣顆粒鏡下觀察顆粒呈菊花狀；由中央和周圍兩部分組成；

革蘭染色：中央為G+（紫藍(lán)色）絲狀體，周圍為粗大的G-（紅色）棒狀體，呈放射狀排列。蘇木精伊紅染色：中央為紫色，末端膨大，部分為紅色。放線菌屬細(xì)菌鑒定10微生物學(xué)檢驗(yàn)分離培養(yǎng)：血平板、或牛心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基；

菌落特點(diǎn)：菌落質(zhì)地致密，表面呈緊密的絨狀，或堅(jiān)實(shí)、干燥而多皺。由于基內(nèi)菌絲長在培養(yǎng)基內(nèi)，所以菌落與培養(yǎng)基結(jié)合較緊，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。放線菌屬細(xì)菌鑒定11(二)諾卡菌屬（Nocardia）1.專性需氧菌2.含分枝菌酸3.形態(tài)：與放線菌相似，但菌絲末端不膨大4.分布：土壤中，多數(shù)不致病菌5.致病菌星形諾卡菌（N.asteroides）巴西諾卡菌（N.brasiliensis）諾卡菌屬細(xì)菌鑒定12臨床意義侵入途徑：呼吸道或皮膚創(chuàng)傷；所致疾病：諾卡菌??；外源性感染，好發(fā)于免疫缺陷患者；化膿性感染：肺部：肺炎、肺膿腫，等腦部：腦膿腫、腦膜炎等等……諾卡菌屬細(xì)菌鑒定13微生物學(xué)檢驗(yàn)色素顆粒壓片(類似硫磺顆粒)：在感染的組織內(nèi)及膿液中也為類似硫磺樣顆粒，呈淡黃色、紅色及黑色不等，稱為色素顆粒。諾卡菌屬細(xì)菌鑒定14涂片染色特點(diǎn)1：

革蘭染色：革蘭陽性桿菌，但著色不均；非常重要諾卡菌屬細(xì)菌鑒定15涂片染色特點(diǎn)2：

抗酸染色：呈弱陽性，著色不均；非常重要諾卡菌屬細(xì)菌鑒定16涂片染色特點(diǎn)3

：

菌絲斷裂現(xiàn)象：陳舊培養(yǎng)染色時(shí)菌絲部分出現(xiàn)斷裂成鏈桿狀或球桿狀，呈T形或V形排列；非常重要諾卡菌屬細(xì)菌鑒定17分離培養(yǎng)：沙保羅瓊脂、或普通瓊脂培養(yǎng)基；

菌落特點(diǎn)：大小不等、表面干燥有皺褶、顆粒狀、菌落邊緣陷入培養(yǎng)基中；不同種類可產(chǎn)生不同色素（如橙紅、黃等）諾卡菌屬細(xì)菌鑒定18放線菌感染類型。。。。。。常見感染菌。。。。。。病理特點(diǎn)。。。。。。菌落特征。。。。。。染色特征。。。。。。諾卡菌感染類型。。。。。。常見感染菌。。。。。。病理特點(diǎn)。。。。。。菌落特征。。。。。。染色特征。。。。。。要點(diǎn)復(fù)習(xí)放線菌屬和諾卡菌屬細(xì)菌鑒定19課后思考題諾卡菌和放線菌的菌落特征及染色特性？諾卡菌屬細(xì)菌鑒定非結(jié)核分枝桿菌鑒定

學(xué)習(xí)目標(biāo)１了解非結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)性狀２了解非結(jié)核分枝桿菌的致病特點(diǎn)３了解結(jié)核分枝桿菌的微生物學(xué)檢查近期典型NTM醫(yī)院感染事件1998年4月深圳市婦兒醫(yī)院嚴(yán)重醫(yī)院感染事件，共有166例患者發(fā)生龜分枝桿菌感染；1998年福建南平市某醫(yī)院因玻璃注射器消毒不規(guī)范導(dǎo)致59人發(fā)生偶發(fā)分枝桿菌感染。

非結(jié)核分枝桿菌鑒定非結(jié)核分枝桿菌鑒定定義及特點(diǎn)

定義：

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。

特點(diǎn)：

對酸、堿比較敏感

對常用的抗結(jié)核菌藥物較耐受

生長溫度不如結(jié)核分枝桿菌嚴(yán)格

多存在于環(huán)境中、為條件致病菌

可引起結(jié)核樣病變而受關(guān)注

抗原與結(jié)核分枝桿菌有交叉非結(jié)核分枝桿菌鑒定分類根據(jù)菌落色素和生長速度分為4組：第Ⅰ組：光產(chǎn)色菌（堪薩斯、海）第Ⅱ組：暗產(chǎn)色菌（瘰疬、斯氏）第Ⅲ組：不產(chǎn)色菌（鳥-胞內(nèi)、蟾蜍）第Ⅳ組：迅速生長菌（偶發(fā)、龜）非結(jié)核分枝桿菌鑒定致病性

致病特點(diǎn)：

以全身中毒癥狀和局部損傷為主；

AIDS患者通常并發(fā)感染，呈現(xiàn)播散性所致疾?。?/p>

肺病、淋巴結(jié)炎、皮膚病、骨病等非結(jié)核分枝桿菌鑒定NTM醫(yī)院感染特點(diǎn)多發(fā)生于手術(shù)部位、注射部位聚集性、遷延性、難治性；感染人數(shù)多，傷口經(jīng)久不愈；醫(yī)院感染暴發(fā)常見菌：主要是快速生長分枝桿菌，以龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌最為常見；基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)多見。

非結(jié)核分枝桿菌鑒定微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)蜔嵊|酶試驗(yàn)：區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與NTM；NTM的實(shí)驗(yàn)室診斷可根據(jù)細(xì)菌生長速度、色素等表型特征進(jìn)行初步鑒定、然后進(jìn)行分子生物學(xué)診斷。非結(jié)核分枝桿菌鑒定結(jié)核分枝桿菌鑒定

學(xué)習(xí)目標(biāo)１熟悉結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)性狀２熟悉結(jié)核分枝桿菌的致病特點(diǎn)３掌握結(jié)核分枝桿菌的微生物學(xué)檢查31

態(tài)生兩魘之愁，嬌襲一身之病。淚光點(diǎn)點(diǎn)，嬌喘微微。嫻靜時(shí)如蛟花照水，行動(dòng)處弱柳扶風(fēng)。啥病？概述根據(jù)小說的描寫，林黛玉患的應(yīng)是一種慢性病。她“從會(huì)飲食時(shí)便吃藥，到今日未斷，請了多少名醫(yī)修方配藥，皆不見效”。“每歲至春分秋分之后，必犯舊疾”，并且病癥主要表現(xiàn)是咳嗽、咳痰、數(shù)量不等的咯血。

肺結(jié)核！??！CaseReport概述結(jié)核分枝桿菌：又稱“結(jié)核桿菌”，是人和動(dòng)物結(jié)核病的病原菌；致命的美麗概述34放線菌目（Actinomycetates）：

分枝桿菌屬(Mycobacterium)

放線菌屬（Actinomyces）：

諾卡菌屬

(Nocardia)分類：（1）含分枝菌酸

—諾卡菌屬

—分枝桿菌屬

—棒狀桿菌屬（2）不含分枝菌酸

—放線菌屬概述一類細(xì)長彎曲的桿菌，因有分枝生長的趨勢而得名主要特點(diǎn)：（1）細(xì)長彎曲，分枝狀生長（2）細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)（分枝菌酸）（3）抗酸染色呈陽性（4）生長大多緩慢（5）引起疾病都呈慢性，并伴有肉芽腫分枝桿菌屬概述IWGMT分類緩慢生長菌結(jié)核分枝桿菌群光產(chǎn)色菌暗產(chǎn)色菌不產(chǎn)色菌迅速生長菌不能培養(yǎng)菌麻風(fēng)分枝桿菌概述37分枝桿菌屬種類Runyon分類概述38

結(jié)核分枝桿菌

（Mycobacteriumtuberculosis）結(jié)核分枝桿菌鑒定39WeShouldRemember……結(jié)核是一個(gè)古老的傳染性疾病，也是在基礎(chǔ)理論、實(shí)驗(yàn)診斷方面較為落后的病種

------需努力！結(jié)核分枝桿菌鑒定MTB包括:

人結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）牛分枝桿菌（M.bovis）非洲分枝桿菌（M.africanum）坎納分枝桿菌（M.canettii）田鼠分枝桿菌（M.microti）等前四種細(xì)菌對人類致病，其中人型MTB感染的發(fā)病率最高一、分類結(jié)核分枝桿菌概述

1.形態(tài)及染色

細(xì)長略彎曲、分支狀、單個(gè)、條索狀或短鏈狀；

抗酸染色陽性，呈紅色；

有莢膜；二、生物學(xué)性狀結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性2.培養(yǎng)特性：饞、懶、丑、頑、變饞：營養(yǎng)要求高，專性需氧,羅氏培養(yǎng)基。懶：生長緩慢，18h/代，2-4W可見菌落生長。丑：菌落乳白或米黃，表面粗糙呈菜花樣。液體培養(yǎng)基：菌膜生長最適pH=6.5-6.8結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性四抗抗干燥抗酸堿抗堿性染料抗青霉素四怕怕紫外線怕酒精怕抗癆藥物怕濕熱頑：對某些理化因素抵抗力較強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性形態(tài)結(jié)構(gòu)變異典型形態(tài)－→細(xì)菌的L型卡介苗－→牛結(jié)核桿菌的減毒株毒力變異多重耐藥的菌株（MDR-MTB）耐藥性變異變：毒力、耐藥性、形態(tài)等均可變異變異性結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性糖類發(fā)酵試驗(yàn)（－）觸酶試驗(yàn)（+）熱觸酶試驗(yàn)（－）3.生化反應(yīng)與非結(jié)核分枝桿菌鑒別試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性

全球

約1/3人口已感染

2000萬活動(dòng)性MTB患者年增900萬年死亡300萬（我國12.7萬）結(jié)核分枝桿菌致病性卡介苗：

牛型結(jié)核桿菌經(jīng)13年230代培養(yǎng)，制成減毒活菌苗（卡介苗），廣泛用于預(yù)防接種。預(yù)防結(jié)核分枝桿菌致病性WHO已把結(jié)核病與AIDS、瘧疾一起列為人類的最主要?dú)⑹纸Y(jié)核分枝桿菌致病性49世界結(jié)核病日第19個(gè)世界防治結(jié)核病日主題：你我共同參與，依法防控結(jié)核——發(fā)現(xiàn)、治療并治愈每一位患者不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，無侵襲性的酶。四、致病性與免疫性結(jié)核分枝桿菌致病性傳播與擴(kuò)散通過各種途徑，引起各種結(jié)核細(xì)菌呼吸道消化道破損皮膚粘膜擴(kuò)散侵犯多種組織和器官引起相應(yīng)的結(jié)核病體內(nèi)血液淋巴管消化道支氣管結(jié)核分枝桿菌致病性所致疾病肺部感染：肺結(jié)核肺外感染：腦、腎、骨、關(guān)節(jié)、生殖器官等

全身播散性結(jié)核

消化道結(jié)核

皮膚結(jié)核結(jié)核分枝桿菌致病性胞內(nèi)感染菌，主要依賴細(xì)胞免疫；人類對結(jié)核桿菌的感染率很高，但發(fā)病率缺較低，這表明人體感染結(jié)核桿菌可獲得一定的抗結(jié)核免疫力，但不能預(yù)防再感染；傳染性免疫：結(jié)核分枝桿菌（或BCG）進(jìn)入機(jī)體后使機(jī)體對細(xì)菌再次入侵有免疫力，而當(dāng)細(xì)菌或其成分從體內(nèi)徹底消失后機(jī)體的免疫力也隨之消失。免疫性結(jié)核分枝桿菌致病性

熒光定量PCR

芯片雜交

分子生物學(xué)

抗原抗體檢測細(xì)胞因子檢測

免疫學(xué)

萋尼染色+熒光染色羅氏培養(yǎng)+分枝桿菌快速培養(yǎng)

病原學(xué)結(jié)核分枝桿菌鑒定五、微生物學(xué)檢驗(yàn)

病原學(xué)檢驗(yàn)是結(jié)核病確診的主要依據(jù)！55診斷能力低結(jié)核分枝桿菌鑒定診斷方法落后結(jié)核分枝桿菌鑒定根據(jù)感染部位不同選擇不同的標(biāo)本肺結(jié)核---痰（晨痰，連續(xù)送檢三次）腎或膀胱結(jié)核---尿液腸結(jié)核---糞便結(jié)核性腦膜炎---腦脊液膿胸、腹膜炎等---胸腹水廢棄物處理：高壓滅菌是首選1.標(biāo)本采集結(jié)核分枝桿菌鑒定（1）形態(tài)學(xué)檢查---染色鏡檢！1）直接涂片法

2）濃縮集菌涂片法（2）

核酸檢測---PCR推薦使用結(jié)核分枝桿菌鑒定2.直接檢查濃縮集菌痰液、尿、糞等涂片染色分離培養(yǎng)4%NaOH、3%HCl或6%H2SO4處理15min離心、沉淀結(jié)核分枝桿菌鑒定染色鏡檢涂片染色

（1）抗酸染色法：齊-尼（Ziehl-Neelsen）染色（2）熒光染色法：金胺O染色

最常用結(jié)核分枝桿菌鑒定

齊-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色原理

分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多，染色時(shí)與石碳酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗3%鹽酸酒精的脫色作用。初染5％石炭酸復(fù)紅脫色3％鹽酸酒精復(fù)染堿性美藍(lán)結(jié)果分枝桿菌呈紅色，其他細(xì)菌和背景物質(zhì)為藍(lán)色抗酸染色步驟結(jié)核分枝桿菌鑒定抗酸染色原理堿性復(fù)紅脫色復(fù)染抗酸菌非抗酸菌結(jié)核分枝桿菌鑒定熱染法冷染法經(jīng)典方法方便、安全

關(guān)于抗酸染色的兩種常見方法：結(jié)核分枝桿菌鑒定抗酸染色涂片結(jié)核分枝桿菌鑒定

結(jié)核分枝桿菌金胺“O”染色結(jié)核分枝桿菌鑒定半定量報(bào)告抗酸染色：抗酸桿菌（1000×）熒光染色：抗酸桿菌（450×）未找到抗酸菌00±1~2/300視野1~2/70視野1+1~9/100視野2~18/50視野2+1~9/10視野4~36/10視野3+1~9/視野4~36/視野4+>9/視野>36/視野

涂片鏡檢的報(bào)告方式結(jié)核分枝桿菌鑒定

濃縮集菌法涂片鏡檢結(jié)果如何向臨床報(bào)告？結(jié)核分枝桿菌鑒定直接涂片時(shí)應(yīng)在生物安全柜中操作！結(jié)果應(yīng)報(bào)告：“（未）檢出抗酸桿菌”！注意事項(xiàng)

涂片優(yōu)點(diǎn)：

涂片缺點(diǎn)：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽性結(jié)果，故陽性率低。特異性較低：只能報(bào)告“抗酸菌陽性”，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌。傻：鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能辨別死、活菌。假陰性：異煙肼治療后TB會(huì)失去抗酸性！簡便、快速、價(jià)廉、可作療效評(píng)估結(jié)核分枝桿菌鑒定意義：是結(jié)核病病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”！是開展進(jìn)一步檢測的基礎(chǔ)，如藥敏。結(jié)核分枝桿菌鑒定3.培養(yǎng)鑒定前處理：

目的：殺死雜菌、液化標(biāo)本方法：4%NaOH法、等培養(yǎng)基選擇：羅氏培養(yǎng)基、等接種培養(yǎng)：固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法結(jié)核分枝桿菌鑒定3.培養(yǎng)鑒定羅-琴培養(yǎng)基饞：含血清、蛋黃、馬鈴薯、等懶：2-5周丑：菜花樣菌落2-5周后結(jié)核分枝桿菌鑒定藥敏試驗(yàn)生化鑒定染色鏡檢報(bào)告方式培養(yǎng)結(jié)果—無細(xì)菌生長1+斜面20個(gè)菌落以上，占斜面1/4以下2+斜面上菌落生長面積占1/4以上，1/2以下3+斜面上菌落面積占斜面1/2以上，3/4以下4+斜面上菌落生長密集，成菌苔培養(yǎng)結(jié)果的報(bào)告方式結(jié)核分枝桿菌鑒定BACTECMGIT960優(yōu)點(diǎn)：陽性率更高（較涂片法）報(bào)告時(shí)間更快：12-14d縮短藥敏結(jié)果：6-12d結(jié)核分枝桿菌鑒定儀器法

培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：敏感性：高（較涂片法）特異性：高（較涂片法）可確證：是金標(biāo)準(zhǔn)！療效評(píng)估：最后連續(xù)5次培養(yǎng)陰性--“治愈”！藥敏：為后續(xù)藥敏試驗(yàn)提供菌株。結(jié)核分枝桿菌鑒定

培養(yǎng)缺點(diǎn)：需時(shí)：常達(dá)8周！操作：復(fù)雜?。ㄝ^涂片法）成本：高（較涂片法）生化反應(yīng)噬菌體鑒定法分子生物學(xué)鑒定：

PCR、及其相關(guān)性技術(shù)，如PCR-RFLP、SSCP、etal.高效液相色譜法（HPLC）結(jié)核分枝桿菌鑒定4.鑒定結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌抗原檢測結(jié)核分枝桿菌抗體檢測全血干擾素測定法

結(jié)核分枝桿菌鑒定5.免疫學(xué)診斷概念：是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來測定機(jī)體對結(jié)核桿菌是否能引起變態(tài)反應(yīng)的一種試驗(yàn)，以判斷機(jī)體對結(jié)核桿菌有無免疫力。結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌鑒定材料舊結(jié)核菌素(

oldtuberculin,OT)：結(jié)核桿菌加熱處理后提取的粗制品，主要為結(jié)核菌蛋白純蛋白質(zhì)衍化物(purifiedproteinderivative,PPD)：三氯醋酸沉淀后的純化物方法常規(guī)試驗(yàn)：OT或PPD5單位皮內(nèi)注射前臂內(nèi)側(cè)硬結(jié)直徑48-72h