生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

第五節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)包含了其分子的所有信息，并決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)和其功能密切相關(guān)。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)1、同功能蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬

差異與分子進(jìn)化

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)同功能蛋白質(zhì)：不同生物體中表現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)，又稱同源蛋白質(zhì)。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)對(duì)比不同生物的同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以發(fā)現(xiàn)，它們長(zhǎng)度相同或相近，而且許多位置的氨基酸是相同的。這些相同的氨基酸殘基稱為不變殘基。不變殘基對(duì)于同源蛋白的功能是必需的。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)其它對(duì)于不同種屬有相當(dāng)大變化的殘基稱為可變殘基。根據(jù)可變殘基能推測(cè)生物種屬間在系統(tǒng)發(fā)生上的聯(lián)系。同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性稱為順序同源性。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0

恒河猴1

兔9

袋鼠10

牛、豬、羊、10

狗、驢11

馬12

雞、火雞13不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目

生物與人不同的AA數(shù)目響尾蛇14

海龜15

金槍魚21

角餃23

小蠅25

蛾31

小麥35

粗早鏈孢霉43

酵母44

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)根據(jù)細(xì)胞色素C的順序種屬差異建立起來的進(jìn)化樹生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病分子病：由于基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，使蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能減退或喪失，甚至造成生理功能的變化而引起的疾病，稱為分子病。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖

-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…鐮刀形紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)2、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系核糖核酸酶的變性與復(fù)性生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)牛核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性Anfinsen實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能目錄生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)肌紅蛋白(Mb)由153個(gè)氨基酸殘基組成,血紅蛋白(Hb)的α亞基有141個(gè)氨基酸,β亞基有146個(gè)氨基酸殘基。MbandHb的兩種亞基氨基酸殘基數(shù)和序列均有變化，但它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎完全相同。說明肌紅蛋白和血紅蛋白的α亞基和β亞基都起源于一個(gè)共同的祖先。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)在血紅蛋白和肌紅蛋白分子中與輔基血紅素相連的氨基酸都是組氨酸。說明不同氨基酸序列中只有關(guān)鍵的氨基酸不變才能產(chǎn)生相同的構(gòu)象，執(zhí)行相同的功能。這種關(guān)鍵氨基酸通常提供形成蛋白質(zhì)構(gòu)象的必要基團(tuán)。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)肌紅蛋白和血紅蛋白的每條鏈都含一個(gè)血紅素輔基。血紅素由四個(gè)吡咯環(huán)構(gòu)成的原卟啉Ⅸ和一個(gè)鐵離子組成。作為亞鐵離子，可形成6個(gè)配位鍵：其中4個(gè)與卟啉與環(huán)的氮原子連接，第五個(gè)與His93相連，第六個(gè)與氧可逆結(jié)合附近有個(gè)His64輔助氧的結(jié)合。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)血紅蛋白與氧結(jié)合的協(xié)同性肌紅蛋白與血紅蛋白都能與氧結(jié)合，但肌紅蛋白是單體蛋白而血紅蛋白是四聚體蛋白。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)血紅蛋白氧飽和度在溶液中血紅蛋白分子上已結(jié)合氧的位置數(shù)與可結(jié)合氧的位置數(shù)之比稱為飽和度（saturation)。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)肌紅蛋白氧飽和度生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)PO2=13.33kPaPO2=2.67kPaHb釋放氧Mb釋放氧生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)Mb和Hb的氧合曲線比較

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)Hb的輸氧功能Mb的儲(chǔ)氧功能生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)血紅蛋白與氧結(jié)合的分子機(jī)制生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

脫氧血紅蛋白亞基間的交聯(lián)鍵

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)第六節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)和等電點(diǎn)pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++OH-+H++OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)在溶液中解離成帶電顆粒，在電場(chǎng)中可以向與其電荷相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為：電泳生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)不同種類的蛋白質(zhì)由于等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)指定pH條件下所帶電荷的性質(zhì)和多少也不相同，加上它們分子量大小、顆粒形狀的不同，因此在電場(chǎng)中移動(dòng)的方向和速度各不相同。根據(jù)這一原理可用此方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和分析。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)1）圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。2）平板電泳：鋪有凝膠的平板上進(jìn)行的電泳。+—-+生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

聚丙烯酰胺凝膠電泳既可以作為蛋白質(zhì)純度檢驗(yàn)方法，也可以純化、制備蛋白質(zhì)。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)PAGE垂直平板電泳示意圖低濃度濃縮膠高濃度分離膠聚丙烯酰胺凝膠電泳具有三種物理效應(yīng)：①濃縮效應(yīng)②分子篩效應(yīng)③電荷效應(yīng)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)

由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征。可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對(duì)水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層，同時(shí)這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)透析與超過濾簡(jiǎn)易裝置生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量及其測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量很大，一般在104~106或更大。蛋白質(zhì)的分子量除了根據(jù)其化學(xué)組成來測(cè)定外，主要是利用蛋白質(zhì)的某些物理化學(xué)性質(zhì)來測(cè)定。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)1、沉降速度法是利用超速離心機(jī)測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的一種方法。將蛋白質(zhì)溶液放在超速離心機(jī)的離心管中進(jìn)行超速離心。60000~80000rpm.使蛋白質(zhì)分子沉淀下來，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子大小和形狀相同時(shí)下沉速度也會(huì)相同，在離心管中產(chǎn)生一個(gè)明顯的界面，利用光學(xué)系統(tǒng)可以觀察到此界面的移動(dòng)，從而測(cè)定蛋白質(zhì)的沉降速度。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)超離心法最為準(zhǔn)確，但需昂貴的超速離心機(jī)。用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度。蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)，因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，但對(duì)分子形狀高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品驅(qū)動(dòng)馬達(dá)真空冷凍生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)一種蛋白質(zhì)在單位離心力場(chǎng)里的沉降速度。常用S（Svedbergunit)表示。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）

x=蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)已測(cè)得許多蛋白質(zhì)的S值都在1×10-13~200×10-13之間，因此，采用1×10-13S作為沉降系數(shù)的一個(gè)單位。例如：某蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)為30×10-13S，可用30S表示。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格〔Svedberg〕方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量：

M=RST/D〔1－iρ〕R：氣體常數(shù)T：絕對(duì)溫度

D：擴(kuò)散系數(shù)i:蛋白質(zhì)的偏微比容

ρ：溶劑的密度生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)2、凝膠過濾（又稱分子篩層析）是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。原理是：使用葡聚糖凝膠（商品名Sephadex)和瓊脂糖凝膠（商品名Sepharose）。該凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔大小用交聯(lián)劑與葡聚糖或瓊脂糖的比例來實(shí)現(xiàn)。這些網(wǎng)孔只允許較小的分子進(jìn)入珠內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。當(dāng)用洗脫液洗脫時(shí)被排阻的大分子先洗脫下來，小分子后洗下來。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)凝膠過濾法生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)①當(dāng)kd=0時(shí)，Ve=Vo，溶質(zhì)全從Vo出來，無分配。②當(dāng)kd=1時(shí)，Ve=Vo+Vi，溶質(zhì)全進(jìn)篩子，各物質(zhì)盡管有分配，但各物質(zhì)不能分開。③當(dāng)0〈kd〈1時(shí)，Ve=Vo+kd·Vi,各溶質(zhì)具不同分配，得以分離。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳相對(duì)遷移率：蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)距離與前沿物質(zhì)移動(dòng)距離的比值。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的沉淀

如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。沉淀方法類別:

1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）

2、酸鹼（等電點(diǎn)沉淀）

3、有機(jī)溶劑沉淀

4、重金屬鹽類沉淀

5、生物堿試劑和某些酸類沉淀

6、加熱變性沉淀生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)鹽析法:在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的硫酸銨、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（saltingout）。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)2.鹽溶和鹽析

鹽溶：低濃度的中性鹽在蛋白質(zhì)分子表面形成雙電層，使蛋白質(zhì)溶解度增加；鹽析：高濃度的中性鹽破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，使蛋白質(zhì)溶解度降低，發(fā)生沉淀析出。

分段鹽析：不同蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度不同，蛋白質(zhì)溶液中，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)3.有機(jī)溶劑沉淀法

a有機(jī)溶劑（與水相溶）爭(zhēng)取蛋白質(zhì)顆粒上的水膜，使之沉淀。

b有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮

c低溫操作，邊加入邊攪拌，防止局部過熱，引起變性，盡量縮短處理時(shí)間。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)變性與復(fù)性

●蛋白質(zhì)各自所特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是表現(xiàn)其物理性質(zhì)和化學(xué)特性以及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。當(dāng)天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學(xué)因素的影響，使其分子內(nèi)部原有的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致其一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱為變性作用（denaturation）。

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)表征：生物活性喪失；物理性質(zhì)（溶解度、粘度、擴(kuò)散系數(shù)、光譜特性等）和化學(xué)性質(zhì)（化學(xué)反應(yīng)，被酶解性）改變應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)性●蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性（renaturation）。生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測(cè)定范圍：0.1～0.5mg/ml生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)酚試劑反應(yīng)→蛋白質(zhì)定量、定性

茚三酮反應(yīng)測(cè)定常用方法

生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)雙縮脲反應(yīng)

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物紅紫色絡(luò)合物(鹼性溶液)Cu2+生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)第七節(jié)蛋白質(zhì)的分類根據(jù)分子形狀分類球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)根據(jù)組成分類簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)活性蛋白質(zhì)（如酶蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、保護(hù)和防御蛋白、受體蛋白…...）根據(jù)功能分類非活性蛋白質(zhì)（如硬蛋白、角蛋白）生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)分類生物化學(xué)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)結(jié)