表面化學(xué)分析 表面表征 共聚焦熒光顯微鏡橫向分辨的測(cè)量 征求意見(jiàn)稿

GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20151表面化學(xué)分析表面表征共聚焦熒光顯微鏡橫向分辨的測(cè)量本文件描述了一種通過(guò)對(duì)尺寸比預(yù)期分辨小得多的物體成像來(lái)測(cè)定共聚焦熒光分辨的方法。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)pointspreadfunction成像系統(tǒng)對(duì)點(diǎn)光源或點(diǎn)狀物體的響應(yīng)。3.2橫向分辨lateralresolution在樣品表面平面內(nèi)或在與圖像形成光學(xué)器件的軸線(xiàn)成直角的平面內(nèi)能可信區(qū)分成分變化所對(duì)應(yīng)的測(cè)量距離。4符號(hào)和縮略語(yǔ)下列符號(hào)和縮略語(yǔ)適用于本文件。APD：雪崩光電二極管（avalanchephotodiode）CFM：共聚焦熒光顯微鏡（confocalfluorescencemicroscope）FWHM：半高峰寬（fullwidthathalf-maximum）LSCM：激光掃描共聚焦顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope）NA：數(shù)值孔徑（numericalaperture）OL：物鏡（objectivelens）PMT：光電倍增管（photomultipliertube）PSF：點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)（pointspreadfunction）QD：量子點(diǎn)（quantumpoint）5概述GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:201525.1背景信息度，因此空間分辨可以得到提高[2]。像相比，根據(jù)熒光波長(zhǎng)所形成的圖像具有更好的對(duì)比度，且在一張圖像中進(jìn)行多色成像也是可能的。處理。通過(guò)CFM對(duì)薄膜或納米級(jí)物體進(jìn)行成像和化學(xué)分析的過(guò)程中，當(dāng)物體軸向尺寸明顯小于CFM軸向分辨的典型數(shù)值時(shí)，橫向分辨尤為重要。不同的制造商常用不同的方法來(lái)表征儀器的空間分辨。本文件提供了一種測(cè)量CFM儀器橫向空間分辨的方便、有效方法，它適用于非專(zhuān)業(yè)操作者使用。本文件中的術(shù)語(yǔ)和分析程序符合ISO18516[3]。5.2CFM的操作類(lèi)型5.2.1概要這里根據(jù)樣品的激光聚焦掃描技術(shù)來(lái)描述不同操作模式的CFM。本文件的主要對(duì)象為臺(tái)式掃描CFM和激光掃描CFM。5.2.2臺(tái)式掃描CFM由于CFM中涉及的光學(xué)器件是靜止的，因此光路簡(jiǎn)單且?guī)缀醪恍枰S護(hù)。光學(xué)準(zhǔn)直過(guò)程中的像差或漂移被最小化。掃描區(qū)域的大小只受樣品掃描臺(tái)的機(jī)械運(yùn)動(dòng)的影響，因此可以進(jìn)行大面積掃描。精細(xì)單元進(jìn)行成像。5.2.3激光掃描CFM此保持了樣品的狀態(tài)。限，且掃描區(qū)域的大小還取決于物鏡的放大倍率。在這種情況下，優(yōu)先使用具有高NA（具有較好的采集效率和較高的分辨）的低倍物鏡（具有較大的掃描區(qū)域）。5.2.4轉(zhuǎn)盤(pán)式CFM高速轉(zhuǎn)盤(pán)會(huì)涉及多個(gè)激光焦點(diǎn)和共軛探測(cè)器針孔。5.3影響CFM橫向分辨的參數(shù)5.3.1概要通過(guò)測(cè)量CFM的PSF橫向尺寸來(lái)評(píng)估橫向分辨。光學(xué)顯微鏡空間分辨的理論極限為：GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20153阿貝分辨X,Y=λ/2NA和阿貝分辨Z=2λ/NA2相關(guān)參數(shù)的全面綜述和確定PSF尺寸的實(shí)驗(yàn)方案可通過(guò)文獻(xiàn)[2,5~7]獲得。5.3.2物鏡激光聚焦尺寸和采集體積取決于物鏡（OL）的NA，因此物鏡對(duì)CFM圖像的橫向分辨有直接影響。5.3.3探測(cè)針孔的尺寸和鏡筒透鏡的焦距探測(cè)針孔的最佳尺寸須由操作人員來(lái)酌情選擇。由于探測(cè)針孔經(jīng)鏡筒透鏡和OL在樣品平面上的成像尺寸比其實(shí)際尺寸更為重要，因此也宜對(duì)OL和鏡筒透鏡的放大倍率進(jìn)行規(guī)定。5.3.4激光照明光束的準(zhǔn)直和純度只要照明光束經(jīng)準(zhǔn)直且填充OL的背孔，就可能達(dá)到OL的預(yù)期性能。5.3.5激光照明的偏振性輸入激光的偏振性會(huì)影響PSF的形狀和尺寸。線(xiàn)性偏振光照明會(huì)沿著偏振方向拉長(zhǎng)PSF[8]。5.3.6激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)不同于（大于）激發(fā)波長(zhǎng)，它會(huì)降低分辨[2]。5.3.7圖像對(duì)比度為了準(zhǔn)確測(cè)量橫向分辨，要求CFM圖像具有好的對(duì)比度。影響CFM圖像對(duì)比度的經(jīng)驗(yàn)因素包括光學(xué)器件的清潔度、信號(hào)強(qiáng)度、噪聲、光電探測(cè)器的靈敏度、光路的通量和光束偏振性等。6通過(guò)對(duì)小尺寸物體成像來(lái)測(cè)量橫向分辨6.1背景信息可通過(guò)對(duì)一個(gè)非常小的物體成像來(lái)估算CFM的橫向分辨。由于可從單一的CFM圖像中獲得直接顯由于小物體的有限尺寸對(duì)其在CFM圖像中所觀(guān)察到的尺寸有貢獻(xiàn)，因此所觀(guān)察到的圖像代表了PSF和熒光納米顆粒。圖1給出了通過(guò)CFM測(cè)量熒光珠以及提取用于估算FWHM的譜線(xiàn)輪廓的示意圖。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20154圖1獲得的熒光圖像及用于估算CFM儀器橫向分辨的單個(gè)熒光珠橫截面輪廓的FWHM6.2樣品選擇和樣品要求如果熒光納米顆粒的尺寸與CFM的PSF的尺寸相當(dāng)，則需要一去卷積過(guò)程來(lái)推導(dǎo)顯微鏡的實(shí)際于300nm的PSF，典型PSF尺寸的四分之一為75nm，這表明能使用75nm的納米顆粒作能通過(guò)其它高分辨顯微鏡來(lái)獲得，如原子力顯微鏡和電子顯微鏡。中進(jìn)行超聲清洗，然后再用H2O進(jìn)行清洗，等離子體清洗同樣有效[10,11]。6.3儀器運(yùn)行前的參數(shù)設(shè)置通過(guò)CFM獲得的圖像質(zhì)量取決于操作者的技能和實(shí)驗(yàn)參數(shù)。在給定的參數(shù)設(shè)置下，不同的操作者件并不強(qiáng)制要求在操作CFM儀器時(shí)使用特定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。與之相反，操作者可根據(jù)自己的決定選擇合適的實(shí)驗(yàn)參數(shù)來(lái)優(yōu)化CFM成像。這些參數(shù)包括但不限于激發(fā)激光的波長(zhǎng)和光束質(zhì)量、照明光束的偏振分之一，也就是說(shuō)，橫向分辨的數(shù)值范圍宜定義為至少5個(gè)像素[3,4]。6.4數(shù)據(jù)采集和分析6.4.1選擇合適的光斑有所不同，典型的程序如下：1)開(kāi)啟激光，確保通向樣品的光路暢通，且所有光學(xué)器件都安裝到位。2)安裝可獲得的具有最高NA的物鏡。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:201553)將制備好的樣品置于顯微鏡載物臺(tái)上，通過(guò)目鏡或相機(jī)顯示器觀(guān)察，使其緊密聚焦。4)轉(zhuǎn)動(dòng)或調(diào)整必要的濾光器輪或分束器，使得從樣品表面反射的激光能被光電探測(cè)器探測(cè)到。5)在監(jiān)測(cè)光電探測(cè)器輸出的過(guò)程中，在最小的激光功率條件下調(diào)節(jié)OL與樣品之間的距離或探測(cè)針孔的位置（若可調(diào)），使得光電探測(cè)器的輸出最大化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)聚焦的微調(diào)。6)在仍能提供好的圖像對(duì)比度的前提下，使用探測(cè)針孔的最小尺寸。這一步驟主要取決于操作者的判斷。7)精細(xì)聚焦后，插入長(zhǎng)通濾光器或控制計(jì)算機(jī)，使得阻擋激光進(jìn)入光電探測(cè)器的長(zhǎng)通濾光器就位，提高激光功率。8)若所用儀器能以線(xiàn)掃描方式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)光電探測(cè)器的輸出且樣品是高度熒光的，則能通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光光強(qiáng)和使用長(zhǎng)通濾光器來(lái)調(diào)整焦點(diǎn)和針孔位置，以嘗試改善聚焦和準(zhǔn)直。9)確定掃描方向、圖像大小、像素?cái)?shù)和掃描速度（或像素駐留時(shí)間）。10)進(jìn)行成像并保存數(shù)據(jù)用于分析。測(cè)量FWHM。在選擇亮斑時(shí)，應(yīng)符合以下條件：1)亮斑應(yīng)是孤立的且不與相鄰的斑點(diǎn)重疊。建議對(duì)儀器進(jìn)行檢查。6.4.2通過(guò)譜帶平均處理提取譜線(xiàn)輪廓為了獲得單個(gè)光斑輪廓的代表性FWHM，應(yīng)使用譜帶平均處理方法。首先選擇由多條（至少5條）成線(xiàn)條得到的。圖2給出了在單個(gè)熒光光斑上進(jìn)行譜線(xiàn)輪廓譜帶平均處理的過(guò)程。譜帶應(yīng)沿著微珠輪廓的短軸和長(zhǎng)軸方向選擇。為了用于FWHM的估算，得到的譜線(xiàn)輪廓應(yīng)滿(mǎn)足以下兩個(gè)條件：1)譜線(xiàn)輪廓的總長(zhǎng)度宜至少是預(yù)期分辨的5倍[3]。也是用于估算橫向分辨的橫截面輪廓兩側(cè)平臺(tái)的峰高之間的最大變化值。圖2提取用于FWHM估算的代表性譜線(xiàn)輪廓的譜帶平均處理6.5數(shù)據(jù)記錄測(cè)得的PSF的FWHM直接受OL和激光激發(fā)和探測(cè)波長(zhǎng)的影響，因此只有在正確描述這些實(shí)驗(yàn)參數(shù)時(shí)，橫向分辨才有意義。應(yīng)提供的其它相關(guān)參數(shù)包括：a)CFM的操作類(lèi)型：臺(tái)式掃描或激光掃描。b)OL的規(guī)格：空氣、油浸、水浸、NA和放大倍率。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20156預(yù)計(jì)針孔尺寸是一個(gè)可供選擇的參數(shù)，它可在此說(shuō)明。d)激發(fā)波長(zhǎng)和探測(cè)波長(zhǎng)。e)輸入光的偏振態(tài)。f)樣品上激光焦點(diǎn)的功率。g)樣品描述：用于成像的納米顆?；騋D的已知尺寸。h)圖像區(qū)域的大小，單位為μm。i)x和y方向上的像素?cái)?shù)。j)快速掃描方向。k)用于測(cè)量橫向分辨的譜線(xiàn)輪廓的信噪比。l)CFM圖像中單個(gè)顆粒在x軸和y軸的FWHMs。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20157樣品制備與數(shù)據(jù)和分析示例A.1樣品制備這里介紹了使用熒光納米珠作為測(cè)試樣品來(lái)測(cè)量CFM橫向分辨的一個(gè)示例。只要顆粒能被近似為一個(gè)點(diǎn)光源，則任何類(lèi)型固定在平面基底上的納米米顆粒的橫向尺寸不宜超過(guò)預(yù)期分辨的四分之一。顆粒?；椎那鍧嵆潭确浅Ｖ匾捎肞iranha溶液[6]進(jìn)行清洗，也可在堿性的1MKOH溶液中進(jìn)行超聲清洗，然后再用H2O進(jìn)行清洗，等離子體清洗同樣有效[7,8]。制備樣品的實(shí)際操作步驟如下：進(jìn)行清洗。2)KOH浸泡時(shí)間為30min，丙酮和水清洗時(shí)間分別為15min；KOH溶液可溶解附著在載玻片上的無(wú)機(jī)物，丙酮可去除有機(jī)物，最后用水清洗掉載玻片上的所有物質(zhì)。3)重復(fù)步驟2）2~3次后，利用空氣輕輕吹干載玻片。5)通過(guò)旋涂（5000rpm、60s）分別下，使用稀釋200000倍的懸濁液得到的樣品通常每100μm2上有幾十個(gè)顆粒。A.2數(shù)據(jù)采集和分析這里采用德國(guó)Witec公司生產(chǎn)的Alpha300型CFM對(duì)6.1詳細(xì)的獲取顆粒圖像的實(shí)驗(yàn)程序如下：行優(yōu)化。測(cè)器，從而顯著提高圖像的對(duì)比度。該芯的尺寸相當(dāng)于2倍的艾里斑。5)通過(guò)激光掃描樣品臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的光柵掃描，獲得CFM圖像。圖A1給出了沿著x和y方向進(jìn)行譜帶平均處理得到的同一GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20158圖A.1同一光斑的譜帶平均譜線(xiàn)輪廓A.3數(shù)據(jù)記錄表A.1數(shù)據(jù)記錄示例488nm樣品處為（2~3）μW5μL黃色熒光珠（Invitrogen公司）水溶液旋涂在載玻直徑約20nm60×60pixelsx軸0.33Hz（242.2±3.8）nm（242.1±3.8）nmGB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20159[1]ISO18115-1,Surfacechemicalanalysis—Vocabulary—Part1:Generaltermsandtermsusedinspectroscopy.[2]STELZERE.H.K.Contrast,resolution,pixilation,dynamicrangeandsignal-to-noiseratio:Fundamentallimitstoresolutioninfluorescencelightmicroscopy,JournalofMicroscopy,v189(1998)pp.15-24.[3]ISO18516,Surfacechemicalanalysis—AugerelectronspectroscopyandX-rayphotoelectronspectroscopy—Determinationoflateralresolution.[4]WILKENINGG.&KOENDERSL.Nanoscalecalibrationstandardsandmethods.Chapter21.Wiley-VCH,2005.[5]COLER.W.,JINADASAT.,BROWNC.M.Measuringandinterpretingpointspreadfunctionstodetermineconfocalmicroscoperesolutionandensurequalitycontrol,NatureProtocols,[6]ZUCKER,R.M.ConfocalMicroscopy.MethodsandProtocols.EvaluatingConfocalMicroscopySystemPerformance.Springer,2006.[7]MURRAYJ.M.,APPLETONP.L.,SWEDLOWJ.R.,WATERSJ.C.Evaluatingperformanceinthree-dimensionalfluorescencemicroscopy.JournalofMicroscopy,v228(2007)pp.390-405.[8]KIMJ.,KIMD.C,BAEKS.H.Demonstration