《奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建技術(shù)規(guī)程》

DB24

黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)

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奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建技術(shù)規(guī)程

起草人：鄭家三

單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

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郵箱：zjs3399@

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

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奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建操作技術(shù)規(guī)程。

本標(biāo)準(zhǔn)為奶牛蹄部趾間皮膚感染性疾病的研究提供基礎(chǔ)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

3術(shù)語定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1皮膚外植體

從活體動(dòng)物切取下來進(jìn)行培養(yǎng)的那部分皮膚組織叫做皮膚外植體。

4要求

4.1外植體皮膚來源的要求

4.1.1以新屠宰的奶牛蹄部趾間皮膚為實(shí)驗(yàn)樣本。

4.1.2外植體所用的皮膚需從無蹄部疾病且蹄形結(jié)構(gòu)良好的奶牛后蹄處采集。

4.2實(shí)驗(yàn)人員要求

4.2.1實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)具備一定的獸醫(yī)外科知識(shí)，且熟練掌握獸醫(yī)外科手術(shù)操作。

4.2.2實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)熟練掌握組織/細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

4.2.3實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)熟練掌握病理組織學(xué)和免疫組織化學(xué)知識(shí)，并熟悉病理切片制作方法。

4.2.4實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)具備分析病理組織切片的技術(shù)能力。

5外植體構(gòu)建方法

5.1培養(yǎng)基配置

5.1.1運(yùn)輸培養(yǎng)基

DMEM/F-121:1培養(yǎng)基內(nèi)添加1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100X），5μg/mL硫

酸慶大霉素，1%L-谷氨酰胺。

5.1.2洗滌培養(yǎng)基

DMEM/F-121:1培養(yǎng)基內(nèi)添加1%青霉素+鏈霉素+兩性霉素B（100X），2μg/mL硫酸慶

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大霉素。

5.1.3組織培養(yǎng)基

DMEM高糖與DMEM/F-121:1培養(yǎng)基以3:1比例混合，添加1%青霉素+鏈霉素+兩性霉素

B（100X），5μg/ml硫酸慶大霉素，1%L-谷氨酰胺，4U/ml胰島素，0.4μg/ml氫化可

的松，10%胎牛血清。

5.2樣本的采集、運(yùn)輸

選取新屠宰的、無蹄部疾病且蹄形結(jié)構(gòu)良好的黑白花奶牛。首先用清水和皮膚清潔劑反

復(fù)沖洗蹄部直至表面無污物，隨后用無菌手術(shù)刀片和剪刀去除趾間皮膚被毛，PBS緩沖液

沖洗后，更換新的無菌手術(shù)刀切除全部趾間皮膚，PBS沖洗后立即放入準(zhǔn)備好的運(yùn)輸培養(yǎng)基

中，冰上運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室。

5.3奶牛趾間皮膚外植體的組裝

將采集的趾間皮膚用8mm皮膚活檢打孔器無菌收集外植體皮膚，并浸入預(yù)熱至37℃的

洗滌培養(yǎng)基中，室溫下洗滌3次，15min/次。

取500μL體積分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖作為底座置于12孔培養(yǎng)板最下層，為皮膚外植體

提供物理支撐，其上覆蓋0.5cm2無菌手術(shù)紗布，洗滌后的外植體置于紗布和瓊脂糖底座的

頂部（圖1）。添加組織培養(yǎng)基至表皮與真皮交界處，形成氣相與液相交替的培養(yǎng)系統(tǒng)。將

組裝的外植體模型置于37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12h換液1次，于培養(yǎng)0、12、

24、36、48和72h收集2塊皮膚外植體，分別固定于4%多聚甲醛和保存于‐80℃冰箱中。

圖1皮膚外植體模型組裝圖

6奶牛趾間皮膚外植體可行性檢測

6.1皮膚組織切片制作

采用黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院病理課題組的國家發(fā)明專利方法《動(dòng)物組織石蠟

切片的綠色環(huán)保制作技術(shù)》制作石蠟組織切片。

6.2病理組織學(xué)檢查

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按照蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒說明書的步驟對組織切片進(jìn)行HE染色，隨后封片顯

微鏡下觀察，根據(jù)建立的評分標(biāo)準(zhǔn)對出現(xiàn)不同病理變化的皮膚外植體進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如

下所示。

表1皮膚外植體病理組織學(xué)評分表

皮膚外植體病理組織變化評分

表皮細(xì)胞變性（壞死）0分

出現(xiàn)以下描述的表皮和真皮所有變化現(xiàn)象（組織不可行）

多灶性表皮下裂

基底層細(xì)胞空泡化（表皮變性）

1分

外分泌腺、白細(xì)胞和表皮細(xì)胞出現(xiàn)核固縮和脫離，顯示自溶跡象

（組織不可行）

伴有中性粒細(xì)胞變性的基底層細(xì)胞多灶性固縮

角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

基底層細(xì)胞空泡化

上皮裂開1.5分

小汗腺和周圍神經(jīng)有自溶的跡象，一些濾泡上皮細(xì)胞（組織可行）

(脫落)也有自溶的跡象。

棘細(xì)胞層出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象

毛囊周圍的一些基底下裂隙2分

腺體內(nèi)很少有脫落的上皮細(xì)胞（組織可行）

2.5分

散在凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞

（組織可行）

可觀察到正常的組織結(jié)構(gòu)和活力，偶爾在分泌腺內(nèi)有少量脫3分

落的上皮細(xì)胞。（組織可行）

6.3Caspase-3蛋白表達(dá)檢測

按照SP檢測試劑盒說明說的步驟對組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，隨后封片顯微鏡

下觀察，對皮膚外植體中Caspase-3凋亡蛋白的陽性表達(dá)進(jìn)行評分。選擇5個(gè)不同高倍視野，

根據(jù)以下指標(biāo)對陽性細(xì)胞強(qiáng)度進(jìn)行評分。

1）陽性率：陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，反映陽性細(xì)胞所占百分比。對細(xì)胞陽性比

率進(jìn)行評分：0～5%為4分，6%～25%為3分，26%～50%為2分，51%～75%為1分，>75%

為0分。

2）陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度：測量區(qū)域平均陽性強(qiáng)度為0,1,2,3分，陰性無著色，計(jì)3分；

弱陽性淡黃色，計(jì)2分；中陽性棕黃色，計(jì)1分；強(qiáng)陽性棕褐色計(jì)0分。

3）陽性評分：陽性綜合評分為陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分值×陽性細(xì)胞比率分值，數(shù)據(jù)越小

說明綜合陽性強(qiáng)度越強(qiáng)。

6.4TUNEL細(xì)胞凋亡檢測

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按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟對組織切片進(jìn)行染色，Dapi復(fù)染后封片

觀察，計(jì)算視野內(nèi)1000個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占觀察同類細(xì)胞的百分比，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)

胞數(shù)量/1000×100%。對細(xì)胞凋亡率進(jìn)行評分：細(xì)胞凋亡率在0～5%為4分，6%～25%為3分，

26%～50%為2分，認(rèn)為模型可行；細(xì)