高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法

PAGEI高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法1范圍本文件規(guī)定了高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢測的引物、儀器設(shè)備、試劑耗材、檢測步驟、結(jié)果判定、防止交叉污染和廢棄物處理的措施等。本文件適用于高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株的PCR檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SN/T2102.1食源性病原體PCR檢測技術(shù)規(guī)范第1部分：通用要求和定義SC/T7014水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范SC/T7015染疫水生動物無害化處理規(guī)程SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科發(fā)光桿菌屬美人魚發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個亞種，廣泛分布于全球海洋環(huán)境中，可以感染魚類、甲殼類、軟體動物、海龜、鯨豚類等不同的海洋動物。該菌種不同菌株因攜帶的毒力基因不同，對宿主呈現(xiàn)出高致病性、低致病性和無致病性。本文件界定的高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種是指感染宿主后能引起發(fā)病，最短可在1天內(nèi)造成魚類等宿主死亡并引發(fā)流行性疾病的菌株。4PCR引物4.1hlyB基因的特異引物正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'4.2dly基因的特異引物正向序列dly-F:5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'5儀器設(shè)備和試劑耗材5.1儀器設(shè)備無菌操作臺、臺式離心機、恒溫金屬浴、PCR儀、漩渦振蕩器、生物安全柜、微量移液器、核酸電泳儀、凝膠成像儀、高壓滅菌鍋等。5.2試劑耗材超純水、2×PCRMix（含dNTP、Mg2+、DNA聚合酶）、SYBRGreenI染料、ROX參比染料、組織裂解液（含1%TritonX-100、2mMEDTA、20mMTris-HCl、0.2%SDS、20mM硫酸銨、1%甜菜堿）、瓊脂糖（電泳級）、DNA分子量標準（DL2000Marker）等試劑。離心管、研磨棒、移液槍頭、PCR管等耗材。6檢測步驟6.1待檢樣品的核酸模板制備參照《SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)》和《SC/T7014水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范》的相關(guān)規(guī)定，檢查待檢病樣的外觀癥狀，并在無菌操作臺中對主要病灶部位進行無菌取樣。隨后剪取0.1g~0.2g病灶部位的組織樣品置于1.5mL離心管中，用研磨棒研磨，加入200μL組織裂解液和300μL滅菌的超純水，充分振蕩混合均勻后，置于恒溫金屬浴上37℃保持5min~10min，使組織充分裂解（也可采用具有同等DNA抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取試劑盒）。隨后，用離心機8000rpm離心2min，獲取上清液，吸取10μL上清液至一個新的無菌離心管中，并加入90μL超純水對上清液進行稀釋，振蕩混勻后即作為待檢樣品的DNA核酸模板。6.2PCR反應(yīng)體系的配置分別在200μL的PCR反應(yīng)管中制作兩個獨立的20μLPCR反應(yīng)體系。其中一個反應(yīng)體系標記為體系A(chǔ)，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的hlyB基因正向序列引物2μL，10μM的hlyB基因反向序列引物2μL，制備好的DNA模板4μL，加無菌超純水至總體積為20μL。另一個反應(yīng)體系標記為體系B，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的dly基因正向序列引物2μL，10μM的dly基因反向序列引物2μL，制備好的DNA模板4μL，加無菌超純水至總體積為20μL。分別在A、B兩個反應(yīng)體系中加入4μL6.1小節(jié)中制備好的DNA核酸模板，即完成PCR反應(yīng)體系的配置。陰性對照反應(yīng)體系以等體積無菌超純水替代DNA模版。反應(yīng)體系配置完成后，振蕩均勻并瞬時離心后，迅速將反應(yīng)管置于PCR儀中。6.3PCR擴增6.3.1PCR反應(yīng)條件按照如下條件進行PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性2min；95℃變性10s，60℃退火40s，72℃延伸20s，擴增40個循環(huán)。隨后，保持72℃延伸10min。6.3.2PCR產(chǎn)物的電泳分別將體系A(chǔ)和體系B的10μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，以及陰性對照的PCR產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。6.3.3結(jié)果觀察將完成電泳后的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠成像儀器中觀察結(jié)果，并拍照記錄。7結(jié)果判定7.1檢測結(jié)果成立的條件體系A(chǔ)的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，體系B的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，兩個體系的特異性條帶需同時出現(xiàn)且陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后均未出現(xiàn)條帶（見附錄A），則檢測結(jié)果成立。否則，檢測結(jié)果不成立。7.2結(jié)果判定7.2.1在檢測結(jié)果成立的前提下，檢測結(jié)果判定為陽性，即該樣品為高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染。7.2.2如果被檢測樣品體系A(chǔ)中的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置出現(xiàn)一條特異性條帶，但體系B中的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置沒有出現(xiàn)特異性條帶，且陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后未出現(xiàn)條帶，則該樣品被美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染，但該菌株不具有高致病性。7.2.3如果被檢測樣品體系A(chǔ)中的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置、體系B中的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置都沒有出現(xiàn)特異性條帶，或者被檢測樣品體系A(chǔ)中的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置沒有出現(xiàn)特異性條帶，但體系B中的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置出現(xiàn)一條特異性條帶，則該樣品不是被美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染。7.2.4如果陰性對照的相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，可能是陰性對照存在污染或是實驗過程操作失誤，無論體系A(chǔ)或體系B在相應(yīng)位置是否出現(xiàn)特異性條帶，均需再次重復(fù)進行檢測。上述結(jié)果的判定標準可參見表1。表1檢測結(jié)果的判定標準體系A(chǔ)（檢測hlyB基因）體系B（檢測dly基因）陰性對照結(jié)果判定++-樣品被高致病性PDD感染+--樣品被PDD感染，但不具有高致病性樣品不是被PDD感染-+-+++檢測失敗，需重新進行檢測+-+-++--+8防止交叉污染和廢棄物處理的措施8.1為防止交叉污染所采取的措施應(yīng)按照《SN_T2102.1-2008食源性病原體PCR檢測技術(shù)規(guī)范第1部分：通用要求和定義》的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照《GB19489-2008實驗室生物安全通用要求》的相關(guān)規(guī)定進行無害化處理。8.2被檢測的病樣樣品在檢測完成后應(yīng)按照相關(guān)規(guī)定進行無害化處理。PAGE3附錄A資料性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種不同毒力株P(guān)CR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖圖1美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種hlyB基因的PCR產(chǎn)物電泳圖1-25：不同來源美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株；26：陰性對照；M：DNA分子量標準。圖2美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種dly基因的PCR產(chǎn)物電泳圖1-2：高致病性的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株；3-25：低致病性或無致病性的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株；26：陰性對照；M：DNA分子量標準。附錄B①PDD菌株的hlyB基因全長序列及用于本標準檢測的部分序列（下劃線部分，加粗斜體部分為檢測用引物序列）ATGAATTTAAATCACTTAAGTATTAAGAAAAAACTGATCCTCGCCATGATCAGTGCGGTACTATTTTCTACTGCTCTTGTTGGTATTTTAAGCCAACAACAAGCACGAAAAGTCATTGAAACTCGCTTACTTGAATCGGAAATTCCTGCGACTTTGCTGCAGATTCGCAACCAAATCGATAAAGAAGTTTCCTTGTTGCAAGCAGCGGCACAACAACTGGCAACCAACCCATTAGTGATTGATTCACTCACCGCAACGCTGCCTCAAGATAACACCCAGCTCGTTACCTTACTTAACGAGATCAAGCAGCAATATCATCTATTTGATGCCTCTATTGCGGATCGAAATACAGGAAACTACTGGAACCAAGACGGTTTTTTACGCCAGCTTAACCACCAACAAGATAGCTGGTTCTACAACTTTGTCCGCAGTGGCAACGCTAAGATGCTCAATGTCTTTCGTGAAGCCAATGGTGATGTAAAACTGTTTGTTAATTACCAACAACTCAATGGTAAAGGGCTAGCTGGCTTGTCTAAATCGTTAGATGAAATGGTGCAATTTATTAATCAATTTAAACTTGAGCAAACTGGCTTTGTTTATCTGGTTGATGATAAAGGTATTGTGCGAATTCATAATGATAACCAGTTGATGGGAAAAGCAAGCTTAACCGATTTATACGGTAGCAAGGTGGCAAACCAACTGTTAAAACGAGGCAAAATCGAAATCGTGGATCTTGATCTTGCAGGCCAAGAAAATCTTGTTGCTTCAAGTTATATCCCAACGATGAATTGGTATGTCATCGCCCAATTACCTAAAAATGAAGCGTTTGCGAGCCTCAACCATGCCCGTAATCAAATTTTAATCTGGACTGCCATCATTGCGCTTGGCTTTACTGCGTTAGCGATTTGGCTTGCGAGCTCCATTACCCGTCCAATCGCTCGTTTAGCCGAAATGTTTAAAGATCTTGGTGAAGGTGAAGGCGATCTACGTCATCGTCTAGACATTCAAGGTAACGATGAAATTGCCCAACTGTCCCAAGGCTTTAATGGTTTTATTAGCAAAATCCATAATTCGGTAAAAGAAGTTGCGGAAACAGGAAATGCCCTACGTCACGCCTCTCAATCGGTAGCGGAACAAGCACAAACGACCTTAGATAACAGCCAAAGCCAACGCGATCGCACCATTCAAGTGGTAACCGCGATTAATGAGATGGGGGCAACCGTCAATGAAATTGCAGGTAATGCTGCTCAAGCCGCTGACGCCACTCACCTAGCAGAAACGGAAGCACAAAGTGGTCAACAGGTTGTTGGGCAAGCAAGAGAAACCATTTCACAACTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAGTGATTGAATCTTTGGCCCATAACACCCAAGCCATTGGCAGCATTTTGGATGTGATCCGTGGTATTTCAGAACAAACGAACTTATTGGCATTGAACGCAGCCATTGAAGCAGCTCGTGCTGGTGAGCAAGGTCGTGGTTTTGCCGTTGTTGCTGATGAAGTGCGCAGTCTTGCTAGTCGAACAGCGGCTTCAACTGATGAAATCCAAACTATGATCAACCGTTTACAGCAAGAGGCCAGCAATGCCGTAGCGGCTATCGAGCAAAGTCGCCTGTTAAGTTCCAATGGGGTTTCAGCCTCTGATGAAGCCAGCAGCGCATTGATTTCTATTGCCGAACGTATCACCTTAATTGCAGATATGAATACGCAAGTTGCAACGGCAACAGAAGAACAATCAACAGTGGTTAACGACATCAACTGCAATATCGAAGTGATCAACGAAACCACTCAGCGTACAGCAACCACGGCCGAAGATCTTGCGCAAGCGAGCCTTGAACTGCAGCAATTATCTCACCGATTAGAAGTCATGGTTGGAAGCTTCAAACTTTAA②PDD菌株的dly基因全長序列及用于本標準檢測的部分序列（下劃線部分，加粗斜體部分為檢測用引物序列）ATGAAAATAAAAACGCTTACTATGTTAATTGTGTGCTGCTCCTCAAATGCATATGCTTTTACACAATGGGGAGGTAGCGGTTTAACTCCTATGGGACATGAATGGTTAACGCGAGCCTCAGCTTTAGAGCTTCTTAATTCTGAGGATCTAATAAAGCCAGACCCAGAAGATCCTAGACTTAACTGGACACAAGGCCACGCAAAAAATTTAGATCTTGAAATAGCATCAAATGAAGTATCAAAAATAAAGAATCTAAAAAAAAGTGATAAGCTATACGAACCTAAATATGATGCTATTTTTTCTGCAATTGTTGGTGAACGATGGGTCGATATTGCTGGTTTTAATGTAATAGATGGCTTTATCGGTCAATATGGCCCAGATTGTTTTGATGCGACAGCACAAGAACCAGCAGATCTCCAGCAAGATCATTTCATGCGACGTTATGATGATATCGGAAGCCAAGGAGGCGTTTCTGCAGCAAAAAGAGCTCAAAATCGATTTATTGATCACTTTGTTAATGCTGCAATGGCAAATGAAAAAAGAATATTAGTATGGGATGGTGGAGCATCATCATCAACACAATCTGAAGTAGACTATAATTACTTCTTATTTGGACGAGCGGTCCATTTGTTTCAAGATTCATTTAGCCTAGAGCATACTGTTCGATTACCAGAAGATAATTATAAAAAAATTAGACAAGTCAAAGGATATATTTGTTCTGACAGTTCAGAACAGCATTCTCATAGCAGTTTTACTTCTTCTGATTTCTATGACTCTAATGATGTAATATGGAAGAAAAAATCAAAATCTGATACCGGATGGCAATCATATAAACCAAGTAATATGAAGCCAGCCGCTTTAACTGCACTAGAAGCAAGTAAAGATCTATGGGCTGCTTTTATAAGAACAATGGCAACAAATATTAATGAACGGGAAACTACAGCTAGAAAAGAGGCACAACAATTAATTGATACATGGCTATCTTTTGATGAGGAAGAAATGTTGTCATGGTATGAC