流感病毒的紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)范

流感病毒的紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)范流感病毒的血凝素（HA）能夠引起多種禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，因此而得名。用于檢測(cè)流感病毒滴度的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)也是根據(jù)病毒的這一特性而建立的。當(dāng)血清中特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，則可以抑制紅細(xì)胞凝集的出現(xiàn)，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）的理論根據(jù)。微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)是目前最常用的一種鑒定流感病毒型/亞型的方法。該方法簡(jiǎn)單、易行、結(jié)果可信。用于HI的標(biāo)準(zhǔn)參照血清必須及時(shí)更新，要包括當(dāng)年的疫苗株和/或流行代表株的抗血清。HI中所用的血清必須經(jīng)特殊處理以去除非特異性抑制素及非特異性凝集素。（一）生物安全要求生物安全要求及個(gè)人防護(hù)要求與流感病毒的分離相同，并應(yīng)遵守相應(yīng)的生物安全規(guī)定。（二）實(shí)驗(yàn)所用試劑1.抗原：季節(jié)性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒液2.抗血清：經(jīng)RDE或者過(guò)碘酸鉀處理后的季節(jié)性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒抗血清。（三）其他試劑/材料/儀器（試劑盒中不包含）紅細(xì)胞懸液 PBS緩沖液，PH7.4 水浴箱（37℃，56℃）臺(tái)式離心機(jī) 多道可調(diào)加樣器 離心管7.96孔微量血凝板（使用豚鼠和人紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)須用“U”底板，使用雞/火雞紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好用“V”底板，“U”底板也可使用）、可調(diào)多通道加樣器、單道加樣器等。8.200ul、1000ulTIP頭、水槽流感病毒紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)各項(xiàng)條件比較紅細(xì)胞雞火雞豚鼠人“O”型血終濃度0.50.50.750.75孔底部形狀V型V型U型U型孵育時(shí)間30min30min45min60min紅細(xì)胞沉積形狀細(xì)胞沉積成點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì)胞沉積成點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀（四）流感病毒鑒定步驟1.紅細(xì)胞配置如用火雞、雞的紅細(xì)胞，工作液濃度為1%，如用人“O”型、豚鼠紅細(xì)胞，工作濃度為1.5%。下面介紹WHO流感參比與合作中心提供的紅細(xì)胞標(biāo)定的方法：S液中的紅細(xì)胞，1200r/min離心5min，棄上清。加入等量的PBS液體洗滌，充分混勻，1200r/min離心5min，棄上清。PBS液體洗滌三次。最后一次洗滌后，1200r/min離心10min。將紅細(xì)胞稀釋至合適的濃度。注：A.S液全稱(chēng)為Alsever氏液。配制方法為葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g、去離子水加至100mL，微熱溶解，將pH值調(diào)到6.1，8磅20min高壓滅菌，4℃貯存?zhèn)溆谩?.流感毒株HA滴度的測(cè)定在微量血凝板的第2~12列加入50ulPBS（PH7.4）。在第一列（A1~G1）中加入100ul病毒懸液。H1加入100ulPBS，作為紅細(xì)胞陰性對(duì)照。從第一列各孔吸50ul病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀釋?zhuān)詈笠涣忻靠讞壢?0ul。在每孔中加入50ul紅細(xì)胞懸液，輕拍血凝板，充分混勻。室溫孵育，孵育時(shí)間見(jiàn)表：流感病毒紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)各項(xiàng)條件比較。3.HA試驗(yàn)結(jié)果判斷引起全部紅細(xì)胞凝集為完全凝集，以“+”記錄；只有部分紅細(xì)胞凝集記錄為“+/-”；無(wú)凝集記錄“-”。血凝滴度的判定以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點(diǎn)，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的血凝滴度。HA滴度判定舉例病毒稀釋度HA滴度1:11:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048123456789101112A++----------2B++++--------8C+++++-------16D++++++------32E+++++++-----64F++++++++----128G++++++++++++≥2048H------------＜14.制備用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)的4個(gè)血凝單位的抗原一個(gè)凝集單位指能引起等量的標(biāo)準(zhǔn)化的紅細(xì)胞凝集的病毒量。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)時(shí)一般用4個(gè)血凝單位的病毒量。制備4個(gè)單位血凝抗原時(shí)，首先計(jì)算出紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)所需的病毒抗原的總量。如每種血清做8孔稀釋?zhuān)靠子每乖?5ul，則測(cè)定一份血清需0.2mL抗原。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清的份數(shù)（本試劑盒包含5種標(biāo)準(zhǔn)血清）計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所需病毒抗原總量。其次，計(jì)算出病毒稀釋度。用病毒的HA滴度除以8，得到的商即為配置4個(gè)血凝單位所需的稀釋度。如，某病毒的HA滴度為64，除以8等于8，則1:8（1mL病毒液加7mLPBS）稀釋該病毒即可得到4個(gè)血凝單位的抗原。注：紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中所用的4個(gè)血凝單位是指每25ul病毒液中含有4個(gè)血凝單位（等于50ul病毒液中含有8個(gè)血凝單位）。所需抗原總量為1600ul時(shí)，4個(gè)血凝單位配置對(duì)照表HA滴度病毒液(ul)PBS(ul)168008003240012006420014001281001500256501550512251575102412.51587.520486.251593.755.4個(gè)血凝單位抗原的復(fù)核滴定為了保證紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中抗原用量一致并且準(zhǔn)確無(wú)誤，新配置的4個(gè)血凝單位抗原需復(fù)核滴定。操作方法同HA實(shí)驗(yàn)步驟。如果只有前4孔出現(xiàn)凝集，表明每50ul病毒含有8個(gè)血凝單位，該病毒稀釋準(zhǔn)確，可以用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。如第5孔也出現(xiàn)凝集，說(shuō)明每50ul病毒含有16個(gè)血凝單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，表明每50ul病毒僅含4個(gè)血凝單位，病毒量需加倍。此外，4個(gè)血凝單位抗原必須每次用前新配置。6.紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）鑒定未知病毒在血凝板的每孔加入25ulPBS。然后在A1—A5、A7—A11各列分別加入：抗季節(jié)性A(H1N1)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗季節(jié)性A(H3N2)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗B-Yamagata系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗B-Victoria系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗新甲型H1N1流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清25ul，A6、A12加入25ulPBS，作為陰性對(duì)照。用多道移液器從A行每個(gè)孔分別取25ul，由A至H行做2倍稀釋血清，最后一行棄去25ul。A1至A5各列每孔加入25ul待檢抗原（4個(gè)血凝單位）陽(yáng)性對(duì)照：A7至A11各列分別加入4個(gè)血凝單位的季節(jié)性A(H1N1)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、季節(jié)性A(H3N2)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、B-Yamagata系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、B-Victoria系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、新甲型H1N1流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原各25ul/孔。對(duì)照孔A6、A12各列加入25ulPBS/孔。輕拍，混勻，室溫孵育30min。每孔加入50ul配置好的紅細(xì)胞懸液，輕拍混勻，室溫孵育30-60min，觀(guān)察血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（具體孵育時(shí)間根據(jù)使用的不同種血球來(lái)定，詳見(jiàn)表1。）血凝抑制效價(jià)是完全抑制血凝出現(xiàn)時(shí)血清的最高稀釋度的倒數(shù)。7.鑒定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照血清對(duì)待檢抗原的抑制效價(jià)≥20才可以算為陽(yáng)性。一種待檢抗原不能同時(shí)被兩種或兩種以上的標(biāo)準(zhǔn)血清抑制。待檢抗原標(biāo)準(zhǔn)參照血清有交叉抑制，但與一種亞型（B型流感稱(chēng)為系）的標(biāo)準(zhǔn)參照血清抑制效價(jià)大于其他亞型參照血清4倍以上時(shí)，便可以判定為此種亞型的流感病毒。（五）注意事項(xiàng)血紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)必須用4個(gè)血凝單位/25ul的抗原，抗原必須新鮮配制。紅細(xì)胞懸液的配制必須標(biāo)準(zhǔn)化。正確存放試劑，避免反復(fù)凍融及污染。凍干的試劑應(yīng)按照說(shuō)明溶解，保存。5.任何待檢病毒與一種以上的推薦抗血清反應(yīng)，滴度明顯大于20，可能的原因?yàn)椋菏褂昧瞬蛔?個(gè)血凝單位的抗原。細(xì)菌污染。非流感病毒來(lái)源的凝集素可以非特異的與所有的抗血清反應(yīng)，也可以不發(fā)生反應(yīng)。讀取結(jié)果的時(shí)間不正確，只有當(dāng)病毒的血凝活性恰好被完全抑制時(shí)，血抑結(jié)果才最可信。未充分去除非特異性抑制素。人和動(dòng)物來(lái)源的血清存在非特異抑制素，許多敏感病毒在滴定時(shí)很容易與血清中殘留的非特異性抑制素反應(yīng)而引起曲解，為避免假陽(yáng)性結(jié)果，要求在HI試驗(yàn)前預(yù)先處理血清。非特異性抑制素實(shí)質(zhì)上是游離在血清中類(lèi)似流感病毒受體的唾液酸殘基。這些類(lèi)似受體的多糖類(lèi)物質(zhì)能與病毒血凝素分子上的受體結(jié)合部位結(jié)合，因此用于血凝抑制或其它試驗(yàn)的血清必須徹底清除其中所含的非特異性血凝抑制素。人和動(dòng)物血清中的非特異性血凝抑制素分為α、β、γ三種，這三種