《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型RT-PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》

ICS65.020.30

CCSB44

23

黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB23/TXXXX—XXXX

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型

RT-PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

（征求意見(jiàn)稿）

起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

聯(lián)系人：陳建飛

聯(lián)系電話/p>

聯(lián)系郵箱：chenjianfei@

在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專(zhuān)利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

黑龍江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB23/TXXXX—XXXX

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型

RT-PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型檢測(cè)的樣品采集、病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的技

術(shù)要求。

本文件適用于實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型的診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

副流感病毒5型（ParainfluenzaVirus5，PIV5）

副粘病毒科腮腺炎病毒屬成員之一，1956年首次在猴源腎細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，被命名為猴病毒5型

（Simianvirus5，SV5）。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，

ICTV）2009年將其命名為副流感病毒5型（ParainfluenzaVirus5，PIV5），2016年將其更名為哺乳

動(dòng)物腮腺炎病毒5型（Mammalianrubulavirus5），2018年將其更名為哺乳動(dòng)物正腮紅病毒5型

（Mammalianorthorubulavirus5），感染宿主范圍廣。本文依舊稱(chēng)之為PIV5。

3.2

豬副流感病毒5型（Porcineparainfluenzavirus5,PPIV5）。

1

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1998年德國(guó)首次從患有豬繁殖與呼吸綜合征的仔豬肺臟組織中分離到豬副流感病毒5型（Porcine

parainfluenzavirus5,PPIV5）。2013年韓國(guó)從患有呼吸道癥狀的豬的肺臟組織中分離到PPIV5。2018

年以來(lái)我國(guó)從腹瀉豬的小腸組織或糞便中檢測(cè)到PPIV5，隨后用傳代細(xì)胞系分離到PPIV5。

3.3

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR）。

在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成cDNA,然后以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)體

外擴(kuò)增獲得大量目的基因或DNA片段的技術(shù)。

4實(shí)驗(yàn)室樣品采集與處理

4.1主要器材

4.1.1滅菌手術(shù)刀、剪刀和鑷子。

4.1.2一次性無(wú)菌注射器（5mL、10mL）。

4.1.3微量移液器（200μL、1000μL）及配套吸頭（200μL、1000μL）。

4.1.4離心管（1.5mL、2mL）。

4.1.5樣品保存管（2mL、25mL、50mL）。

4.1.6醫(yī)用防護(hù)服。

4.1.7組織勻漿器（轉(zhuǎn)速:5000r/min～30000r/min；可均質(zhì)樣品范圍：0.03mL～2000mL）。

4.1.8振蕩器（≥100r/min）。

4.1.9臺(tái)式低溫離心機(jī)(溫度：2℃～8℃,轉(zhuǎn)速：≥10000r/min)。

4.1.10冰箱（-20℃）。

4.2主要試劑

4.2.1磷酸鹽緩沖液（PBS），配方見(jiàn)附錄A中的A.1。

4.2.2青霉素（100000IU）。

4.2.3鏈霉素（100000μg）。

4.3樣品采集

4.3.1采集要求

樣品的采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T541-2016的規(guī)定執(zhí)行。

4.3.2糞便

2

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用滅菌注射器吸1mL～2mL發(fā)病豬只的糞便或輕輕擠壓發(fā)病豬的腹部，從肛門(mén)處采集1mL～2mL

糞便，放入2mL樣品保存管，封口，-20℃保存。

4.3.3小腸及內(nèi)容物

用手術(shù)刀剖開(kāi)病死仔豬腹腔，分別在病變明顯的腸管兩端結(jié)扎并在結(jié)扎線外端剪斷，放入25mL

或50mL樣品保存管，封口，-20℃保存。

4.4樣品處理

4.4.1糞便

向樣品保存管中加適量滅菌PBS（含終濃度1000IU/mL青霉素、1000μg/mL鏈霉素）,經(jīng)振蕩

器（2000r/min）震蕩3min～5min，4℃、5000r/min離心20min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)或-20℃

保存、備用。

4.4.2小腸及內(nèi)容物

取適量長(zhǎng)度的小腸剪碎，連同腸內(nèi)容物一并勻漿，用含終濃度1000IU/mL青霉素、1000μg/mL

鏈霉素的PBS按重量體積比制成5倍懸液，4℃條件下5000r/min離心20min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)

或-20℃保存、備用。

5病毒核酸提取

5.1主要器材

5.1.1臺(tái)式低溫離心機(jī)(溫度：2℃～8℃,轉(zhuǎn)速：≥10000r/min)。

5.1.2微量移液器（2.5μL、10μL、200μL、1000μL）及配套吸頭（10μL、200μL、1000μL）。

5.1.3冰箱（-20℃、-70℃）。

5.1.41.5mL無(wú)RNA酶滅菌離心管。

5.2主要試劑

5.2.1RNA提取液：Trizol試劑。

5.2.2酚氯仿抽提液：苯酚、三氯甲烷、異戊醇（25:24:1）混合液。

5.2.3異丙醇（分析純）。

5.2.4DEPC水：焦磷酸二乙酯按0.1%含量加入去離子水中配制而成。

5.2.575%乙醇：無(wú)水乙醇（分析純）與DEPC水按3:1配制而成。

5.3樣品制備

3

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5.3.1糞便、小腸及內(nèi)容物：按4.4處理。

5.3.2陽(yáng)性對(duì)照：已知病毒材料，如PPIV5感染的細(xì)胞。

5.3.3陰性對(duì)照：未感染細(xì)胞或滅菌去離子水。

5.4操作

5.4.1實(shí)驗(yàn)室生物安全按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行。

5.4.2取待檢樣品上清（4.4）、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各300μL于無(wú)RNA酶的滅菌離心管（1.5mL）中，

加500μLRNA提取液（TRIzol試劑），充分混勻，室溫靜置10min；加入500μL酚氯仿抽提液，充

分混勻，室溫靜置10min；在4℃條件下12000r/min離心10min，取上清液（500μL）于新的無(wú)

RNA酶滅菌離心管（1.5mL）中，加入1.0mL異丙醇，充分混勻，在-20℃條件下靜置30min；在4℃

條件下12000r/min離心10min，小心棄上清；加1.0mL75%乙醇，在4℃條件下12000r/min離

心10min，小心棄上清，倒置于吸水紙上，室溫自然風(fēng)干；加入20μLDEPC水溶解RNA沉淀，瞬時(shí)離

心，立即使用或-70℃保存、備用。

5.4.3可采用自動(dòng)化核酸提取儀和配套核酸抽提試劑等效核酸提取試劑和方法提取RNA。

6反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)

6.1主要器材

6.1.1PCR擴(kuò)增儀（96孔或3×32孔或3×21孔，溫度：0℃～100℃，升降溫速率4℃～6℃/S）。

6.1.2電熱恒溫水槽（20℃～100℃）。

6.1.3臺(tái)式低溫離心機(jī)(溫度：2℃～8℃,轉(zhuǎn)速：≥10000r/min)。

6.1.4電泳儀（最大輸出：600V，400mA,240W）和水平電泳槽（容積≥300mL）。

6.1.5凝膠成像儀（分辨率≥130萬(wàn)像素）。

6.1.6微量移液器（2.5μL、10μL、200μL、1000μL）及配套吸頭（10μL、200μL、1000μL）。

6.1.7離心管（1.5mL）。

6.1.8PCR擴(kuò)增管（0.2mL）。

6.2主要試劑

6.2.1反轉(zhuǎn)錄（RT）試劑

5×M-MLV緩沖液。

dNTPs(各10mM)。

RNase抑制劑（40U/μL）。

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反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200U/μL）。

反轉(zhuǎn)引物：隨機(jī)六聚體（Random6mers，10μmol/L）。

6.2.2PCR試劑

10×ExTaqbuffer、2.5mMdNTPs、ExTaq酶。

滅菌去離子水（按GB/T6682的規(guī)定制備）。

引物。

NP9F：5’-CGTGCTTAAAGCATATGAGCGA-3’；

NP326R：5’-ATTAAGCGGAATGATCCCT-3’。

6.2.3電泳試劑

電泳緩沖液：50×TAE貯存液（配方見(jiàn)附錄A中的A.2），臨用時(shí)加蒸餾水（按GB/T6682的

規(guī)定制備）配成1×TAE緩沖液（配方見(jiàn)附錄A中的A.3）。

瓊脂糖：國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的瓊脂糖。

電泳加樣緩沖液：配方見(jiàn)附錄A中的A.4。

DNAMarker（標(biāo)準(zhǔn)分子量）：分子大小范圍100bp～2000bp。

6.3樣品制備

6.3.1糞便、小腸及內(nèi)容物：按4.4處理。

6.3.2陽(yáng)性對(duì)照：已知病毒材料，如PPIV5感染的細(xì)胞。

6.3.3陰性對(duì)照：未感染細(xì)胞或滅菌去離子水。

6.4操作

6.4.1cDNA合成

合成反應(yīng)在20μL體系中進(jìn)行。取5.4制備的總RNA各12.5μL于無(wú)RNA酶的滅菌離心管（1.5mL）

中，加入1μL隨機(jī)6聚體、混勻，70℃水浴10min、冰浴2min，瞬時(shí)離心，依次加入4μL5×M-MLV

緩沖液、1μLdNTPs混合物(各10mM)、0.5μLRNase抑制劑、1.0μL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，混勻，42℃

水浴1h；70℃水浴15min、冰浴3min，得到cDNA溶液，立即使用或置-20℃保存。

6.4.2PCR

將引物（NP9F/NP326R）稀釋到工作濃度10pmol/μL。

PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)在25μL體系中進(jìn)行。在PCR管中依次加入滅菌去離子水17.25μL、10×ExTaqbuffer2.5

μL、2.5mMdNTPs2μL、ExTaq酶0.25μL、上下游引物各0.5μL。在以上體系基礎(chǔ)上，按陰性對(duì)

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照（2μL滅菌去離子水）、待檢樣品（2μLcDNA）、陽(yáng)性對(duì)照（2μLPPIV5cDNA）順序加入擴(kuò)增

模板。

PCR反應(yīng)條件

95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5

min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠板的制備

稱(chēng)取1g瓊脂糖，加入100mL1×TAE電泳緩沖液，微波爐加熱融化，搖勻，待溫度降至40℃左

右時(shí)，加入10mg/mL溴化乙錠（EB）或EB替代物5μL，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。

加樣及電泳

取待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物各5μL、DL2,000DNAMarker5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠

電泳，150V條件下10min～15min。

凝膠成像儀觀察

反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察檢測(cè)結(jié)果、拍照、記錄試驗(yàn)結(jié)果。

6.5試驗(yàn)成立條件

陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)約336bp的目的條帶，同時(shí)，陰性對(duì)照無(wú)目的條帶（參見(jiàn)附錄B中圖B.1）。

6.6結(jié)果判定

符合6.5條件，若待檢樣品泳道有約336bp的目標(biāo)條帶，則判為PPIV5核酸陽(yáng)性（參見(jiàn)附錄B中圖B.1）；

反之，則判為PPIV5核酸陰性（參見(jiàn)附錄B中圖B.1）。

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附錄A

（規(guī)范性）

溶液配制

A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液

稱(chēng)取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.64g，先加適量去離子水（按GB/T6682的規(guī)定制備）溶解，

最后定容至1000mL，混勻。

A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液

稱(chēng)取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）31.21g，先加適量去離子水（按GB/T6682的規(guī)定制備）溶解，

最后定容至1000mL，混勻。

A.1.30.2mL/L磷酸氫二鈉溶液360mL

量取0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，稱(chēng)取氯化鈉38g，

用去離子水（按GB/T6682的規(guī)定制備）溶解，最后定容至5000mL，4℃保存。

A.250×TAE貯存液

稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）242g，乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）37.2g，加入去離子水（按

GB/T6682的規(guī)定制備）800mL，充分?jǐn)嚢枞芙?，加?7.1mL的醋酸，充分?jǐn)嚢?，加去離水定容至1L，

室溫保存。

A.31×TAE緩沖液

用去離子水將50×TAE電泳緩沖儲(chǔ)存液50倍稀釋后即成。

A.4電泳加樣緩沖液

稱(chēng)取乙二胺四乙酸（EDTA）4.4g，溴酚蘭0.25g，二甲苯藍(lán)FF0.25g，加入去離水200mL，加

熱攪拌充分溶解，加入180mL甘油后，用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0，用去離子水定容至500mL，室

溫保存。