專題10-發(fā)酵工程(記憶版)

專題10發(fā)酵工程傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用一、果酒制作1．酵母菌是兼性厭氧微生物。酵母菌進(jìn)行有氧呼吸的反應(yīng)式如下：C6H12O6+6H2O+6O2→6CO2+12H2O；酵母菌進(jìn)行無氧呼吸的反應(yīng)式如下：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2。2．20℃左右最適合酵母菌繁殖，酒精發(fā)酵時一般將溫度控制在18～25℃。二、果醋制作1．醋酸菌是一種好氧細(xì)菌。醋酸生成反應(yīng)式是C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O。2．醋酸菌的最適生長溫度為30～35℃。3.默寫：制作果酒和果醋實驗流程示意圖挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵醋酸發(fā)酵 果酒果醋4.為防止發(fā)酵液被污染，發(fā)酵瓶要清洗干凈，用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒。5.果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可以用（酸性）重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。三、腐乳的制作1．多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。2.毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶可以將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可以將脂肪水解成甘油和脂肪酸。3．將豆腐塊平放在籠屜內(nèi)，將籠屜中的溫度控制在15～18℃。4．現(xiàn)代的腐乳生產(chǎn)是在嚴(yán)格的無菌條件下，將優(yōu)良毛霉菌種直接接種在豆腐上，這樣可以避免其他菌種的污染，保證產(chǎn)品的質(zhì)量。5．默寫腐乳制作的實驗流程示意圖讓豆腐長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制6．鹵湯中的酒可以選用料酒、黃酒、米酒、高粱酒等，含量一般控制在6.12%左右。四、制作泡菜并檢測亞硝酸鹽含量1．泡菜的制作離不開乳酸菌。乳酸菌是厭氧細(xì)菌。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。2．測定亞硝酸鹽含量的原理：在鹽酸酸化的條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成玖瑰紅色染料。將顯色反應(yīng)后的樣品與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行目測比較，可以大致估算出亞硝酸鹽的含量。微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用一、微生物的實驗室培養(yǎng)課題背景防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應(yīng)用微生物的前提。在實驗室培養(yǎng)微生物，一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件條件，另一方面需要確保無處不在的其他微生物無法混入。基礎(chǔ)知識(一)

培養(yǎng)基1.人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)一一培養(yǎng)基。其中，配制成的的基質(zhì)稱為液體培養(yǎng)基，配制成的固體狀態(tài)的基質(zhì)稱為液體狀態(tài)。在液體培養(yǎng)基中加人凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基，它是實驗室中最常用的培養(yǎng)基之一。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。（瓊脂是一種從紅藻中提取的多糖。瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)固態(tài)。）2.雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源(提供碳元素的物質(zhì))、氮源(提供氮元素的物質(zhì))和無機鹽。3.在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時需將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌時需將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧微生物時則需要提供無氧的條件。(二)

無菌技術(shù)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵。無菌技術(shù)圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下幾個方面。對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。消毒是指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。5.實驗室常用的消毒和滅菌方法1）消毒方法：

日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法。在100℃煮沸5～6

min可以殺死微生物細(xì)胞和一部分芽孢。對于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在70～75℃煮30min或在80℃煮15min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。此外，人們也常使用化學(xué)藥劑進(jìn)行消毒，如用酒精擦拭雙手、用消氯氣毒水源等。2）滅菌方法：灼燒滅菌是將微生物的接種工具，如接種環(huán)、接種針或其他金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，

可以迅速徹底地滅菌。此外，在接種過程中，試管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通過火焰灼燒來滅菌。干熱滅菌是將滅菌物品放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃加熱1～2h可達(dá)到滅菌的目的。能耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具等，可以采用這種方法滅菌。高壓蒸汽滅菌是將滅菌物品放置在盛有適量水的高壓蒸汽鍋內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，將其中原有的冷空氣徹底排除后，將鍋密閉，繼續(xù)加熱使鍋內(nèi)的氣壓逐步上升，溫度也隨之升到100℃以上。為達(dá)到良好的滅菌效果，一般在壓力為100kPa，溫度為121℃的條件下，維持15～30min。3）除了以上方法外，實驗室里還用紫外線或化學(xué)藥物進(jìn)行消毒。例如，接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射30min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強消毒效果。實驗操作本實驗用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌的純化培養(yǎng)，可分成制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌兩個階段進(jìn)行。（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算

根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計算配制100mL的培養(yǎng)基時，各種成分的用量。2.稱量

準(zhǔn)確地稱取各種成分。牛肉膏比較黏稠，可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。3.溶化將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放人燒杯，加入少量的水，加熱。當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻棒取出稱量紙。往燒杯中加人稱量好的蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其溶解。加人瓊脂，加熱使其熔化。在此過程中，不斷用玻棒攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。當(dāng)瓊脂完全熔化后，補加蒸餾水至100

mL。4.滅菌將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃條件下，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用幾層舊報紙包緊，5～

8套培養(yǎng)皿作一包，包好后放人于熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃

下滅菌2h。5.倒平板

待培養(yǎng)基冷卻至50℃

左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作正確順序是：dacb（用下圖字母表示）。abcd討論：平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠。將平板倒置，既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染，又可避免培養(yǎng)基中的水分過快揮發(fā)。(二)

純化大腸桿菌微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體，這就是菌落。

稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。討論：在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？避免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種課題延伸為了保持菌種的純凈，需要進(jìn)行菌種的保藏。對于頻繁使用的菌種，我們可以采用臨時保藏的方法。首先，將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。但是，這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法，在3mL的甘油瓶中，裝入1mL后甘油滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保存。二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)（一）篩選菌株在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。(二)

統(tǒng)計菌落數(shù)目在課題1中，我們學(xué)習(xí)了稀釋涂布平板法。這一方法常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。值得注意的是，統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低。這是因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。除了上述的活菌計數(shù)法外，顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法。課題延伸本課題對能分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行了初步的篩選。但是，這只是分離純化菌種的第一步。對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定，還需要借助生物化學(xué)的方法。在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨。氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高。因此，我們可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。三、分解纖維素的微生物的分離基礎(chǔ)知識（一）纖維素與纖維素酶棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，此外，木材、作物秸稈等也富含纖維素。許多商品纖維素都是由天然纖維素制得的，如水溶性的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、不溶于水的微晶纖維素等。纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。正是在這三種酶的協(xié)同作用下，纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)，同樣，也可以為人類所利用。(二)纖維素分解菌的篩選

在篩選纖維素分解菌的過程中，人們發(fā)明了剛果紅染色法，這種方法能夠通過顏色反應(yīng)直接對微生物進(jìn)行篩選。剛果紅(CongoRed，簡稱CR)

是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅一纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。[資料二]選擇培養(yǎng)在將樣品稀釋涂布到鑒別纖維素分解菌的培基之前，可以通過選擇培養(yǎng)增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠能夠從樣品中分離到所需要的微生物。[資料三]剛果紅染色法常用的剛果紅染色法有兩種，一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。方法一

在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋質(zhì)量濃度為1mg/mL的CR溶液，10～15min后，倒去CR溶液，加入物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaCl溶液，15

min后倒掉NaCl溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)透明圈。方法二

配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的CR溶液，滅菌后，按照每200mL培養(yǎng)基加入1mL的比例加入CR溶液，混勻后倒平板。等培養(yǎng)基上長出菌落后，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)明顯的透明圈。課題延伸易錯題醒本課題對分解纖維素的微生物進(jìn)行了初步的篩選。但是，這只是分離純化的第一步。為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是采用對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測定。易錯題醒1.用選擇培養(yǎng)基選擇微生物的方法(1)在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。例如,加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌;加入高濃度的食鹽可以分離出金黃色葡萄球菌。這里的加入是在主要營養(yǎng)成分完整的基礎(chǔ)上加入。(2)改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。例如,缺乏氮源時可以分離出固氮微生物;石油作為唯一碳源時,可以分離出能分解石油的微生物。(3)改變微生物的培養(yǎng)條件。例如,將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境下培養(yǎng),可以分離出耐高溫的微生物。2.辨析分解尿素的細(xì)菌與分解纖維素的微生物的分離(1)分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)①統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低,因為當(dāng)兩個或多個活菌連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落。因此,統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)表示