《水產(chǎn)品中13 種鄰苯二甲酸酯單酯的液相色譜-質(zhì)譜 質(zhì)譜檢測(cè)方法》編制說(shuō)明

《水產(chǎn)品中13種鄰苯二甲酸酯單酯的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜

檢測(cè)方法》編制說(shuō)明

一、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性

鄰苯二甲酸酯主要是人工合成的增塑劑，由其構(gòu)成的塑料產(chǎn)品被廣泛用于畜

禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，據(jù)報(bào)道近年來(lái)使用量呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中

被頻繁檢出。鄰苯二甲酸酯性質(zhì)差異較大，可對(duì)環(huán)境造成直接污染；此外，鄰苯

二甲酸酯還可通過(guò)食物鏈蓄積作用進(jìn)入人體，對(duì)人體器官產(chǎn)生蓄積毒性，危害人

體健康，并且極易發(fā)生轉(zhuǎn)化降解產(chǎn)生初級(jí)代謝產(chǎn)物由此造成的二次污染也不容忽

視。因此對(duì)養(yǎng)殖生物中鄰苯二甲酸酯單酯進(jìn)行控制非常重要。

近年來(lái)，增塑劑濫用造成的環(huán)境殘留與生態(tài)效應(yīng)引起了國(guó)家政府機(jī)構(gòu)和學(xué)者

的廣泛關(guān)注，尤其是增塑劑中鄰苯二甲酸酯與其代謝物長(zhǎng)期存在對(duì)環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)

和人體健康都構(gòu)成極大威脅?？刂起B(yǎng)殖生物中鄰苯二甲酸酯單酯含量，首先要有

科學(xué)有效的檢測(cè)方法。針對(duì)養(yǎng)殖生物體中鄰苯二甲酸酯單酯的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)

準(zhǔn)尚未出臺(tái)。為規(guī)范統(tǒng)一檢測(cè)方法，使檢測(cè)數(shù)據(jù)更具有比較和分析意義，建立一

套科學(xué)有效的檢測(cè)養(yǎng)殖生物中鄰苯二甲酸酯單酯含量的標(biāo)準(zhǔn)方法顯得尤為迫切。

通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)方法的建立，可以極大的壓縮檢測(cè)成本，縮短檢測(cè)時(shí)間，也更便于相

關(guān)部門對(duì)所轄區(qū)域內(nèi)養(yǎng)殖生物體內(nèi)鄰苯二甲酸酯單酯含量情況有客觀準(zhǔn)確了解，

并在此基礎(chǔ)上，采取有效措施，合理監(jiān)管，確保環(huán)境安全，生態(tài)健康。

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則及依據(jù)

1、按照GB/T20001.5-2017《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范第5部分：規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)》要求進(jìn)行

編寫。

2、參照相關(guān)法律、法規(guī)和規(guī)定，在編制過(guò)程中著重考慮了科學(xué)性、適用性

和可操作性。

三、項(xiàng)目背景及工作情況

（一）任務(wù)來(lái)源

根據(jù)《中國(guó)國(guó)際科技促進(jìn)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》的有關(guān)規(guī)

定，經(jīng)中國(guó)國(guó)際科技促進(jìn)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會(huì)及相關(guān)專家技術(shù)審核，批準(zhǔn)《水產(chǎn)

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品中13種鄰苯二甲酸酯單酯的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)

劃，計(jì)劃編號(hào)為：CI2023430.本標(biāo)準(zhǔn)由寧波大學(xué)提出，中國(guó)國(guó)際科技促進(jìn)會(huì)歸口。

（二）標(biāo)準(zhǔn)起草單位

本標(biāo)準(zhǔn)的主要起草單位是寧波大學(xué)、浙江萬(wàn)里學(xué)院、寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、浙

江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位參與起草，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)中重要技術(shù)點(diǎn)的研究

和建議，并參與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的討論。

（三）標(biāo)準(zhǔn)研制過(guò)程及相關(guān)工作計(jì)劃

1、前期準(zhǔn)備工作

項(xiàng)目立項(xiàng)前，項(xiàng)目承擔(dān)單位寧波大學(xué)于2022年6月中旬成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組。

編制組成員查閱、研讀相關(guān)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，廣泛搜集用的相關(guān)的材料。同時(shí)，多次

開展與專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行調(diào)研、交流，廣泛征求標(biāo)準(zhǔn)制定方面的意見和建議。

2、標(biāo)準(zhǔn)起草過(guò)程

2022年8月17日，由寧波大學(xué)在浙江省寧波市寧波大學(xué)寧大賓館多功能會(huì)

議廳線下組織了第一次起草會(huì)議，談?wù)摿藰?biāo)準(zhǔn)的組織構(gòu)架，確定了分工和編制工

作的各項(xiàng)任務(wù)完成時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

2023年10月18日組織了第二次起草會(huì)議，確定下了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的草案。

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)通知公示后，標(biāo)準(zhǔn)編制小組首先組織了標(biāo)注制定工作會(huì)議，各

編寫人員根據(jù)工作計(jì)劃分工和編寫要求開展了相關(guān)工作。在標(biāo)準(zhǔn)起草期間，編制

小組主編單位及參編單位組織了數(shù)次內(nèi)部研討會(huì)和專家咨詢會(huì)，經(jīng)過(guò)多次修改，

于2024年3月完成了標(biāo)準(zhǔn)初稿及編制說(shuō)明的撰寫?作。

3、征求意見情況

標(biāo)準(zhǔn)編制小組先后通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)會(huì)議、電話、微信等多種形式征集?業(yè)專家相關(guān)

意見和建議。針對(duì)征集的意見，標(biāo)準(zhǔn)編制小組召開了研討會(huì)，將收集到的意見進(jìn)

行匯總處理分析，在充分吸納合理意見的基礎(chǔ)上，先后修改和完成標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，于

2024年3月根據(jù)在各單位反饋意見基礎(chǔ)上，形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿并由中國(guó)國(guó)

際科技促進(jìn)會(huì)提交全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)信息平臺(tái)公示。

（四）主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）情況分析

1、方法原理

水產(chǎn)品中的鄰苯二甲酸單酯經(jīng)固相萃取柱富集、凈化后，采用高效液相色譜

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-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。根據(jù)化合物的保留時(shí)間和特征離子峰定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

2、適用范圍

本文件規(guī)定了測(cè)定水產(chǎn)品中鄰苯二甲酸單酯的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

本文件適用于水產(chǎn)品中鄰苯二甲酸單甲酯（MMP）、鄰苯二甲酸單乙酯

（MEP）、鄰苯二甲酸單異丁酯（MiBP）、鄰苯二甲酸單正丁酯（MnBP）、鄰苯

二甲酸單環(huán)己酯（MCHP）、鄰苯二甲酸單芐基酯（MBZP）、鄰苯二甲酸單辛酯

（MOP）、鄰苯二甲酸單異壬酯（MiNP）、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯、鄰

苯二甲酸單（3-羧基丙基）酯（MCPP）、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-酮基己基）酯

（MEOHP）、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-羥基己基）酯（MEHHP）、鄰苯二甲酸單

（2-乙基-5-羧基戊基）酯（MECCP）等13種鄰苯二甲酸單酯的測(cè)定。

3、樣品前處理方法

精確稱量2.50g（濕重，ww）水產(chǎn)品樣品，并轉(zhuǎn)移至50mLPTFE離心管中。

將2mL1M乙酸銨緩沖液（AA，pH6.5）、80μLβ-葡萄糖醛酸酶和內(nèi)標(biāo)（200.0

μg/L）加入管中，將混合物渦旋3min，在37℃和300r/min的黑暗條件下孵育

90min。此過(guò)程結(jié)束后立即加入10mLACN：甲醇（MeOH）（5:5，v/v），然后

超聲萃取20min，并在9.0×103g離心力的條件下離心4min，收集上清液，重復(fù)

上述步驟兩次，合并上清液。將其與5mLACN飽和正己烷混合，并將樣品管快

速搖晃，渦旋3min以除去上清液中的脂肪并再次以相同離心力離心6min。然

后吸取20mL下層溶液至試管中，并于45°C下，氮吹至近干，然后用5mL水：

（ACN:MeOH）（95:5，v/v）復(fù)溶。PolySeryMAXSPE小柱（500mg，6mL）

依次用10mLMeOH和5mL超純水活化，然后將5mL復(fù)溶液（pH，10.5）上

樣，通過(guò)加入氫氧化鈉（NaOH）（10M）來(lái)調(diào)節(jié)復(fù)溶液的pH，上樣完成后，再

用5mL超純水淋洗并用真空泵泵吸以除去水分。用10mLMeOH：乙酸乙酯（EA）

（2%FA，5:5，v/v）洗脫小柱，并于45°C下，使用氮?dú)鉂饪s至近干。最后用

1.0mLMeOH復(fù)溶，并用0.22μmPTFE膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣小瓶中，儲(chǔ)存

在?20°C，待UHPLC-MS/MS分析。

在水產(chǎn)品前處理優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，主要考察水產(chǎn)品樣品中鄰苯二甲酸單酯去葡萄

糖醛酸化孵育條件、不同提取溶劑、不同提取用量、不同提取時(shí)間、不同的固相

萃取柱、固相萃取柱的活化、洗脫試劑以及定容試劑對(duì)回收率的影響。

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PAEs在生物體中可迅速降解為相應(yīng)的單酯，然后通過(guò)P450酶轉(zhuǎn)化為親水性

葡萄糖醛酸綴合物，這給MPAEs的直接提取帶來(lái)很大困難。通過(guò)加入β-葡萄糖

醛酸酶進(jìn)行去葡萄糖醛酸化將MPAEs從親水性葡萄糖醛酸綴合物中分離出來(lái)，

可實(shí)現(xiàn)對(duì)該問題的有效解決。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到去葡萄糖醛酸化緩沖溶液的過(guò)程

的時(shí)間和pH對(duì)酶活性有一定影響。為了最大化去葡萄糖醛酸化效率，進(jìn)一步對(duì)

時(shí)間和pH等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)乙酸銨緩沖液的pH為6.5且酶解時(shí)間為90

min時(shí)，所有目標(biāo)物的回收率范圍在85%~104%（如圖2.1和2.2所示）。后續(xù)的

提取實(shí)驗(yàn)基于這些優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行。

圖2.1乙酸銨緩沖液的pH對(duì)去葡萄糖醛酸化效率的影響

圖2.2去葡萄糖醛酸化時(shí)間對(duì)提取效率的影響

目標(biāo)物提取效率與目標(biāo)物極性和提取溶劑密切相關(guān)。MPAEs的結(jié)構(gòu)及其較

高的lgKOW性質(zhì)決定了其易溶于極性有機(jī)溶劑。根據(jù)相似互溶性原理，采用極性

較高的ACN和MeOH作為萃取溶劑。通過(guò)比較提取后化合物的響應(yīng)與外部標(biāo)準(zhǔn)

校準(zhǔn)曲線中化合物的響應(yīng)，評(píng)估表觀回收率（Rapp）以選擇最佳提取溶劑。結(jié)

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果顯示大多數(shù)目標(biāo)分析物可以用ACN提取，Rapp范圍為81%~101%，但MMP

和MEP的提取效率明顯較差，Rapp分別僅為20%和36%（圖2.3）。而使用極性

較小提取溶劑，如EA和二氯甲烷（DCM）對(duì)目標(biāo)物提取效果明顯較差，同時(shí)

這也說(shuō)明MPAEs極性相對(duì)偏高。為提高M(jìn)MP和MEP的提取效率，本標(biāo)準(zhǔn)用

ACN和MeOH混合萃取以期取得較好的效果。因此，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化兩種溶劑

的比例（3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，v/v），以找到最佳提取溶劑比例。如圖2.4所

示，乙腈：甲醇（5:5，v/v）顯著提高了萃取效率。MMP和MEP的Rapp分別

達(dá)到95%和90%。因此，ACN:MeOH（5:5，v/v）被選為最優(yōu)提取溶劑。同時(shí)

ACN不僅可以去除生物樣品中的蛋白質(zhì)，還可在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)減少部分電離抑制。

圖2.3提取溶液種類的優(yōu)化

圖2.4ACN和MeOH混合提取溶液的比例優(yōu)化

此外，為進(jìn)一步提高該方法的提取效率和重現(xiàn)性，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)混合提取液體

積和超聲提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)混合提取溶劑的體積達(dá)到10mL

時(shí)，整體目標(biāo)物的提取效率相對(duì)較高，Rapp為72.6%~99.6%；且相對(duì)大體積溶

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劑，10mL時(shí)，既滿足了提取效率要求，又避免了試劑浪費(fèi)（如圖2.5所示）。

同理，以10、15、20、30和60min梯度對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化（如圖2.6所

示）。結(jié)果表明，對(duì)于大多數(shù)化合物，萃取效率在10~20min內(nèi)顯著提高，萃取

平衡在20min內(nèi)達(dá)到。重復(fù)上述步驟兩次，Rapp達(dá)到88.3%~101%。將平衡時(shí)

間進(jìn)一步延長(zhǎng)至60min未能提高萃取效率，甚至一些化合物Rapp略有下降，這

可能導(dǎo)致溶劑損失增加?？紤]到更多溶劑損失和耗時(shí)的影響，分別選擇10mL

和20min作為最佳生物樣品的提取溶劑體積和提取時(shí)間。

圖2.5提取溶液體積對(duì)提取效率的影響

圖2.6提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響

由于基質(zhì)的異質(zhì)性，生物樣品的分析極為復(fù)雜，包括色素、維生素、有機(jī)酸、

脂肪和蛋白質(zhì)等多種干擾成分。海水樣品中含有鹽分、重金屬和其他可能干擾分

析實(shí)驗(yàn)靈敏度和準(zhǔn)確性的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，生物樣品前處理過(guò)程中觀察到濃縮

提取物呈淡黃色，這可能是由共存的色素、脂肪和蛋白質(zhì)導(dǎo)致的。因此有必要對(duì)

生物和海水樣品進(jìn)行凈化，以確保有效消除干擾物質(zhì)，并確保盡可能保留待測(cè)試

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的目標(biāo)成分。SPE是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的純化方法，適用于多種樣品的預(yù)處

理。由于其具有回收率高、重現(xiàn)性好、操作靈活、富集系數(shù)高、提取干凈、選擇

性去除干擾和基質(zhì)成分等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)中痕量污染物的提取凈化。

MAXSPE柱是一種混合強(qiáng)陰離子交換柱，有利于弱酸性化合物的富集和樣品中

干擾雜質(zhì)的去除。相比之下，HLBSPE柱是一種通用的吸附柱，可廣泛去除雜

質(zhì)，已用于復(fù)雜樣品中早期的雜質(zhì)去除。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)生物和海水樣品測(cè)試不同的

SPE柱，結(jié)果表明，PolySeryMAXSPE柱和Oasis?PRiMEHLBSPE柱可分別

適用于生物樣品和海水樣品中MPAEs目標(biāo)化合物的富集和純化。PolySeryMAX

SPE柱需要將目標(biāo)化合物溶解在強(qiáng)極性溶劑中，并將該復(fù)溶液的pH調(diào)節(jié)至高于

目標(biāo)物的pKa，以使目標(biāo)化合物完全電離，然后將其加載至Poly-SeryMAXSPE

柱。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了生物樣品復(fù)溶液的pH。結(jié)果表明，復(fù)溶液pH

為9時(shí)，目標(biāo)物可從隨PolySeryMAXSPE柱流出液中流出，但當(dāng)復(fù)溶液的pH

值達(dá)到10.5時(shí)（圖2.7），流出液中未檢測(cè)到目標(biāo)物，這意味著此時(shí)所有目標(biāo)物

可能已完全電離，并且目標(biāo)物與離子交換吸附劑化學(xué)結(jié)合。

圖2.7復(fù)溶溶液pH對(duì)提取效率的影響

為進(jìn)一步提高SPE小柱的萃取性能，本研究對(duì)不同洗脫劑（如2%FAACN、

2%FAMeOH和2%FAMeOH:EA（5:5,v/v））的洗脫效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化（圖2.8）。

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圖2.8洗脫溶劑對(duì)提取效率的影響

圖2.9洗脫液的酸度對(duì)提取效率的影響

結(jié)果顯示，當(dāng)使用5mL2%FAACN和2%FAMeOH作為洗脫劑時(shí)，MBZP、

MEHP、MOP和MiNP的效果不理想。這可能是由于MPAEs的極性差異或洗脫

液的量不足引起的。因此，進(jìn)一步采用2%FAMeOH:EA（5:5,v/v）作為洗脫劑，

并對(duì)洗脫劑的體積進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)使用10mL2%FAMeOH:EA（5:5,v/v）時(shí)，

13MPAEs和IS的回收率良好（圖2.9）。因此，它被選為Poly-SeryMAXSPE小

柱的洗脫劑。當(dāng)MAXSPE小柱洗脫體積分別達(dá)10mL時(shí)，目標(biāo)化合物的Rapp

最高。因此選擇10mL作為最終的洗脫體積。

4、色譜條件

流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈。

柱溫：40℃。

流速：0.35mL/min。

進(jìn)樣體積：10μL。

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色譜柱：WatersACQUITYUPLC?BEHPhenyl（2.1id×100mm，1.7μm）。

在優(yōu)化色譜條件時(shí)，主要考察流動(dòng)相配比、不同改性劑的含量、流動(dòng)相梯度

洗脫程序、流速以及不同色譜柱，獲得最佳的色譜分離條件。

色譜分離過(guò)程中，流動(dòng)相和流動(dòng)相改性劑的選擇對(duì)目標(biāo)化合物的分離、保留

時(shí)間和靈敏度至關(guān)重要。本標(biāo)準(zhǔn)考察了流動(dòng)相的組成，以選擇最佳條件。測(cè)試了

不同的溶劑和添加劑，測(cè)試結(jié)果表明，H2O+0.1%FA（流動(dòng)相A）和ACN+0.1%

FA（流動(dòng)相B）的組成是分析和分離MPAEs的理想組合。流動(dòng)相篩選過(guò)程中，

使用ACN和MeOH作為流動(dòng)相時(shí)，靈敏度幾乎沒有明顯差異。MeOH與ACN

相比可能會(huì)導(dǎo)致更高的系統(tǒng)壓力[133]，因此選擇ACN作為流動(dòng)相。測(cè)試初始流動(dòng)

相A和流動(dòng)相B的不同比例（90:10、80:20、70:30和60:40，v/v），由于13種

MPAEs結(jié)構(gòu)和極性存在差異，利用梯度洗脫來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳分離，并在梯度比例運(yùn)

行后，流動(dòng)相A和流動(dòng)相B在90:10時(shí)獲得了較好的分離效率。然而，MMP、

MEP和MCPP的靈敏度較低，因此進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相改性劑的類型和含量進(jìn)行優(yōu)

化以提高化合物的靈敏度。甲酸銨和甲酸作為首選改性劑，結(jié)果表明化合物在甲

酸條件下有著較高的靈敏度，可能是pH可以改變化合物的電離效率，并且偏酸

性的流動(dòng)相更易提高ESI-模式下目標(biāo)化合物的響應(yīng)。為確定目標(biāo)物達(dá)到最大響應(yīng)

時(shí)甲酸的濃度，設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)（0.1%、0.15%和0.2%，v/v）來(lái)驗(yàn)證。當(dāng)甲酸濃

度為0.1%（v/v）時(shí)，所有化合物的靈敏度最高。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)梯度洗脫程序最終調(diào)節(jié)時(shí)間（至少1.5min）進(jìn)行優(yōu)化，可

提高目標(biāo)檢測(cè)化合物保留時(shí)間的再現(xiàn)性。

表1液相色譜流動(dòng)相線性梯度洗脫程序

時(shí)間（min）流速（mL/min）流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B（%）

00.359010

0.30.359010

10.352080

20.351090

3.50.35595

40.359010

60.359010

在色譜柱的選擇方面，使用XBridgeC18（2.1id×150mm，3.5μm）和UHPLC

XB-phenyl（2.1id×100mm，1.8μm）色譜柱，調(diào)節(jié)色譜條件，分離效果始終不

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理想。選用WatersACQUITYUPLC?BEHPhenyl色譜柱，調(diào)節(jié)色譜條件后，分

離效果和峰形都很好。13種鄰苯二甲酸單酯及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液液相色譜-串

聯(lián)質(zhì)譜色譜圖見圖10。

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圖10目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖

5、質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）。

掃描方式：負(fù)離子掃描。

離子噴霧電壓：5500V。

離子源溫度：500℃。

多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）。

在優(yōu)化質(zhì)譜條件時(shí)，首先選擇合理的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，在本文件中，氘代鄰苯二甲

酸單甲酯、鄰苯二甲酸單乙酯、鄰苯二甲酸單異丁酯、鄰苯二甲酸單正丁酯、鄰

苯二甲酸單環(huán)己酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單辛酯、鄰苯二甲酸單異

-11-

壬酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯、鄰苯二甲酸單（3-羧基丙基）酯、鄰苯

二甲酸單（2-乙基-5-酮基己基）酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-羥基己基）酯、鄰

苯二甲酸單（2-乙基-5-羧基戊基）酯作為鄰苯二甲酸單酯的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

此外，對(duì)目標(biāo)化合物的母離子、子離子、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳質(zhì)

譜條件。對(duì)1.0μg/mL各鄰苯二甲酸單酯及其內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射泵進(jìn)樣

方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定每種化合物的準(zhǔn)分子離子，然后分

別以其準(zhǔn)分子離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，在碎片離子中選擇合適的

定性離子和定量離子，各目標(biāo)化合物最后采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式，優(yōu)化各種

質(zhì)譜參數(shù)，確定最佳監(jiān)測(cè)條件。13種鄰苯二甲酸單酯及其內(nèi)標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

條件見表3。

表3目標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

化合物母離子(m/z)錐孔電壓(V)子離子(m/z)碰撞電壓(V)

MMP179.11077,107*27,10

MMP-D4183.14281*,111.116,10

MEP193.13877.1*,121.118,14

MEP-D4197.14081.1*,150.118,12

MOP277.1277,127.1*18,16

MOP-D4281.14681.1,127.1*20,16

MiBP221.14077*,134.120,12

MiBP-D4225.15280.9*,138.122,18

MnBP221.11577*,149.115,10

MnBP-D4225.14671,81*12,20

MiNP291.24877,141.1*20,18

MiNP-D4295.24881.1,141.1*22,16

MCPP251.124103*,16510,14

MCPP-D4255.114102.9*,168.98,12

MCHP247.14477,97*18,14

MCHP-D4251.15281,97*24,18

MBZP255.14277*,183.116,12

MBZP-D4259.14677.1*,107.120,12

MEHP277.138127.1,134.1*18,14

MEHP-D4281.25280.9,138.1*34,20

MECPP307.140113.1,159.1*28,12

MECPP-D4311.130113.1,159.130,12

MEHHP293.115121*,145.118,13

MEHHP-D4297.24125.1,145.1*18,14

MEOHP291.150113.1,143.1*20,14

MEOHP-D4295.148125.1,143.1*20,14

-12-

注：帶*的為定量離子

6、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍

取一定量13種鄰苯二甲酸單酯及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液于2mL進(jìn)樣瓶中，制

備至少5個(gè)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)系列，鄰苯二甲酸單酯在各點(diǎn)的質(zhì)量濃度分別為1.0μg/L、5.0

μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L（參考濃度），內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量

濃度均為80.0μg/L。

由低濃度到高濃度依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)組分的

質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的峰面積（或峰高）與內(nèi)標(biāo)物峰面積（或峰面積）的

比值乘以內(nèi)標(biāo)物濃度的乘積為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。

7、結(jié)果計(jì)算與表示

（1）定性分析

按照表3中確定的母離子和子離子進(jìn)行檢測(cè)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中

的鄰苯二甲酸單酯保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品中鄰苯二甲酸單酯的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)

偏差小于2.5%，且在樣品中譜圖中的定性離子的相對(duì)豐度（Ksam）與濃度相近的

標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖中對(duì)應(yīng)的定性離子相對(duì)豐度（Ksam）偏差不超過(guò)表4的范圍，則可

判定樣品中存在鄰苯二甲酸單酯。

Ksam=100%..................(1)

?2

式中：

?1×

Ksam—樣品中鄰苯二甲酸單酯定性離子的相對(duì)豐度，%；

A2—樣品中鄰苯二甲酸單酯定性離子對(duì)的峰面積（或峰高）；

A1—樣品中鄰苯二甲酸單酯定量離子對(duì)的峰面積（或峰高）。

Kstd=100%..................(2)

????2

式中：

????1×

Kstd—標(biāo)準(zhǔn)溶液中鄰苯二甲酸單酯定性離子的相對(duì)豐度，%；

Astd2—標(biāo)準(zhǔn)溶液中鄰苯二甲酸單酯定性離子對(duì)的峰面積（或峰高）；

Astd1—標(biāo)準(zhǔn)溶液中鄰苯二甲酸單酯定量離子對(duì)的峰面積（或峰高）。

表4定性確認(rèn)時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

KstdKstd＞5020＜Kstd≤5010＜Kstd≤20Kstd≤10

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Ksam相對(duì)于Kstd

的最大允許偏±20%±25%±30%±50%

差

（2）定量分析

該方法中標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中鄰苯二甲酸單酯的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器的檢

測(cè)線性范圍內(nèi)。

按下列公式（3）計(jì)算出水產(chǎn)品中鄰苯二甲酸單酯的含量：

X=..................(3)

??×?

式中：

?0

X—樣品中鄰苯二甲酸單酯的含量（μg/L）；

Ci—樣品制備液中鄰苯二甲酸單酯的含量（μg/L）；

V—最終定容體積（mL）；

V0—測(cè)定樣品體積（mL）。

（3）結(jié)果表示

當(dāng)測(cè)定結(jié)果小于1.0μg/L時(shí)，保留至小數(shù)點(diǎn)后三位；當(dāng)測(cè)定結(jié)果大于或等于

1.0μg/L時(shí)，保留三位有效數(shù)字。

8、精密度和準(zhǔn)確度

（1）精密度

使用鄰苯二甲酸單酯對(duì)水產(chǎn)品樣品進(jìn)行統(tǒng)一加標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為0.04μg/L、

0.2μg/L和0.4μg/L，加標(biāo)樣進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，設(shè)置3個(gè)批次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5方法的精密度和準(zhǔn)確度

加標(biāo)濃度5μg/kg加標(biāo)濃度20μg/kg加標(biāo)濃度80μg/kg

MPAEs平均回收率平均回收率RSD平均回收率RSD

RSD（%）

（%）（%）（%）（%）（%）

MMP98.97.5101.23.592.95.3

MEP95.810.498.61.491.85.7

MiBP95.25.496.41.798.17.3

MnBP97.13.396.02.691.07.8

MCHP99.53.4102.36.599.81.5

MCPP99.85.995.09.797.87.2

MBZP90.86.9101.13.595.48.8

MOP99.81.499.72.6100.12.4

MEHP99.33.198.96.694.85.2

MiNP95.48.697.14.489.67.8

MEOHP99.44.099.31.397.98.3

-14-

MEHHP95.43.296.22.387.78.9

MECCP97.77.899.82.195.26.2

本文件中各藥物的批內(nèi)變異系數(shù)≤15%，批間變異系數(shù)≤15%。

（2）準(zhǔn)確度

對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為5μg/kg、20μg/kg和

80μg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。整體而言，本方法鄰苯二甲酸單酯的回收率均能滿

足日常檢測(cè)的需求。

9、靈敏度

將鄰苯二甲酸單酯加入實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖生物樣品中，經(jīng)過(guò)前處理富集、凈化后，

經(jīng)過(guò)HPLC-MS/MS檢測(cè)，按信噪比為S/N=3、S/N=10，估算方法檢出限和定量

限，13種鄰苯二甲酸單酯見表6。

表6方法的檢出限和定量限

檢出限定量限

MAPEs相關(guān)系數(shù)基質(zhì)效應(yīng)

（μg/kg）（μg/kg）

MMP0.99790.990.882.93

MEP0.99921.060.812.70

MOP0.99970.930.230.78

MiBP0.99901.030.120.41

MnBP0.99940.990.311.04

MiNP0.99981.070.210.69

MCPP0.99951.020.531.77

MCHP0.99951.000.180.62

MBZP0.99700.930.511.70

MEHP0.99960.990.170.58

MECPP0.99871.040.070.24

MEHHP0.99991.020.140.48

MEOHP0.99991