《水禽腸炎沙門氏菌感染感染特異性抗體檢 測方法 間接凝集法》

ICS11.220

B41

團體標準

T/CVMAXXXXX—2023

水禽腸炎沙門氏菌感染感染特異性抗體檢

測方法間接凝集法

Detectedmethodforinfectiousspecificantibodiesagainstwaterfowl

SalmonellaEnteritidisinfection--indirectagglutinationmethod

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布

T/CVMAXXXXX-2023

水禽腸炎沙門氏菌感染特異性抗體快速檢測技術(shù)

1范圍

本標準規(guī)定了水禽腸炎沙門氏菌感染特異性抗體檢測的試劑與材料、操作步驟和判定方

法。

本標準適用于水禽腸炎沙門氏菌感染的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T1962.1注射器、注射針頭及其他醫(yī)療器械第1部分：通用要求

GB15810一次性使用無菌注射器

GB/T17999.4SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測第4部分：SPF雞血清平板凝集試驗

GB19489實驗室生物安全通用要求

NY/T2838禽沙門氏菌病診斷技術(shù)

3術(shù)語和定義

3.1

惰性載體genericinertcarrier

泛性型惰性載體SE1H是為實現(xiàn)簡便快速檢測抗原或感染抗體的間接凝集試驗檢測而開

發(fā)的專利載體系統(tǒng)（專利號：ZL202010428277.X），能在較高的工作濃度下與不同遺傳背

景的人、畜禽、野生動物等來源的血清、全血不發(fā)生任何肉眼可見的凝集顆粒反應(yīng)，即與上

述來源的血清、全血不產(chǎn)生非特異性凝集反應(yīng)。

3.2

對照試劑controlreagent

為消除血清學(xué)試驗的假陽性反應(yīng)，需要將每一份血清樣品與較高工作濃度的泛性型惰性

載體SE1H懸液進行凝集測試，該泛性型惰性載體S9H懸液稱為對照試劑。

3.3

腸炎沙門氏菌檢測試劑testingreagentforSalmonellaEnteritidis

腸炎沙門氏菌檢測試劑是一種可用于檢測、監(jiān)測和診斷腸炎沙門氏菌感染的新型專利檢

測系統(tǒng)。檢測試劑的研發(fā)基于泛性惰性載體SE1H攜帶腸炎沙門氏菌抗原因子（SE），并且

表面展呈表達單一SE抗原因子。該試劑能夠特異性靶向腸炎沙門氏菌感染產(chǎn)生的抗體，與腸

炎沙門氏菌感染的人和畜禽、野生動物血清在工作濃度條件下產(chǎn)生肉眼可見的陽性凝集顆粒

反應(yīng)，而與非腸炎沙門氏菌感染的不同背景和來源的人、畜禽、野生動物等血清不出現(xiàn)非特

異性交叉凝集反應(yīng)。

1

T/CVMAXXXXX-2023

4試劑與材料

4.1試劑

4.1.1診斷試劑：對照試劑SE1H、腸炎沙門氏菌檢測試劑SE1H-SE，制備方法見附錄

A。

4.1.2腸炎沙門氏菌陰性對照血清（鴨源），由揚州大學(xué)制備、鑒定和保存。

4.1.3腸炎沙門氏菌陽性對照血清（鴨源），由揚州大學(xué)制備、鑒定和保存。

4.1.4磷酸鹽緩沖溶液（PBS），見附錄B。

4.2材料

4.2.1透明玻璃板或玻片（26mm×76mm×2mm）。

4.2.2無菌吸頭。

4.3器械

4.3.11mL一次性無菌注射器（帶針頭），符合GB15810，GB/T1962.1標準要求。

4.3.25μL-50μL微量移液器。

5試驗步驟

5.1對照試驗

5.1.1每次檢測前20min從4℃冰箱中取出腸炎沙門氏菌陽性對照血清、腸炎沙門氏菌陽

性對照血清和無菌PBS，使其恢復(fù)至室溫（20℃-25℃）。用微量移液器吸取充分混勻的對

照抗原和診斷抗原各10μL，垂直滴加在潔凈玻璃板或玻片上，然后迅速分別滴加同量的陽

性血清和陰性血清和無菌PBS，用吸頭混合均勻，涂布成長1.5cm、寬0.5cm的片狀，隨后

不斷搖動玻璃板或玻片，并于2min內(nèi)判定結(jié)果，無需靜置

5.1.2對照試驗成立條件：2min內(nèi)腸炎沙門氏菌陽性對照血清與對照試劑不發(fā)生凝集反

應(yīng)，而與腸炎沙門氏菌檢測試劑出現(xiàn)明顯的陽性凝集顆粒反應(yīng)；陰性對照血清與對照試劑和

腸炎沙門氏菌檢測試劑均不發(fā)生凝集反應(yīng)。

5.1.3若對照試驗不滿足成立條件，則說明試劑失效，需更換試劑并再次進行對照試驗。

5.2血樣采集

5.2.1采血人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，熟練掌握采樣技巧，并遵循嚴格的無菌操作規(guī)程。采血

人員到達禽場后，需嚴格遵守雞場的消毒防疫等相關(guān)規(guī)定，口罩、乳膠手套、防護帽、防護

服、防護鞋穿戴整齊后方可進入現(xiàn)場。

5.2.2采血場所應(yīng)有充足的光線便于肉眼觀察判定現(xiàn)場的凝集顆粒反應(yīng)，建議夏季室溫保

持在25℃~28℃，冬季則在14℃~20℃。

5.2.3采血時用的注射器應(yīng)保持清潔干燥，要有足夠的強度維持操作，使用靈活且方便，

外包裝未破損，并在有效期內(nèi)使用。

2

T/CVMAXXXXX-2023

5.2.4采血一般采用翅靜脈采血法。采血時，助手側(cè)臥保定水禽，助手左手握住水禽雙腿，

右手握住雙翅，將水禽側(cè)放于地面。采血者用大拇指壓迫翅膀根部靜脈，使靜脈充分充血，

以方便采血操作。采血者用酒精棉球消毒翅靜脈區(qū)域后即可進針，在距離靜脈怒張?zhí)幋蠹s0.3

cm處，使針管與近心端血管的夾角約為45°，將針頭的切口面向上進針。針頭輕挑起表皮，

由表皮與肌肉之間的空隙，往血管的遠心端方向推針前行至血管上面，再將針管與血管重疊

成一條直線刺入血管。進針不宜過深，如刺穿血管，皮下很快血腫，采血失敗。稍稍將針頭

輕插進血管，輕拉活塞，吸取0.2-0.5mL血液。采血完畢，用干棉球壓迫采血部位，勿用酒

精棉球。

5.3獲取血清樣品

將存有全血的注射器水平靜置于地面，靜置30-60min后輕輕拔出活塞，血凝塊會隨活塞

被拉出，注射器管中剩余的淡黃色清亮液體即為血清。

5.4樣品檢測

5.4.1用微量移液器吸取充分混勻的對照試劑SE1H和腸炎沙門氏菌檢測試劑SE1H-SE各

10μL垂直滴加在玻板上，然后吸取等體積待檢血清，用吸頭混合均勻，涂布成長1.5cm、

寬0.5cm的片狀，不斷輕輕地晃動玻璃板或玻片，在2min之內(nèi)判定結(jié)果。

5.4.2檢測結(jié)束后遵守生物安全規(guī)則和無菌操作規(guī)則處理檢測樣品，檢測抗原使用后應(yīng)保

存在4℃。

5.5結(jié)果判定

5.5.1凝集試驗陰性：2min內(nèi)血樣與對照試劑不反應(yīng)（混合底質(zhì)均勻一致，未出現(xiàn)凝集現(xiàn)

象），與檢測試劑也不反應(yīng)（見附錄C，圖C.1，陰性）。

5.5.2凝集試驗弱陽性：2min內(nèi)血樣與對照試劑不反應(yīng)，與檢測試劑出現(xiàn)輕微可見的細小

凝集顆粒，晃動時有輕微滑動（見附錄C，圖C.1，弱陽性）。

5.5.3凝集試驗陽性：2min內(nèi)血樣與對照試劑不反應(yīng)，與檢測試劑出現(xiàn)明顯凝集塊，底質(zhì)

稍有渾濁（見附錄C，圖C.1，陽性）。

5.5.4集試驗強陽性：2min內(nèi)血樣與對照試劑不反應(yīng)，與檢測試劑出現(xiàn)大的凝集塊，底質(zhì)

清亮（見附錄C，圖C.1，強陽性）。

5.5.5當(dāng)凝集反應(yīng)結(jié)果為弱陽性、陽性和強陽性，可判定該只水禽為腸炎沙門氏菌感染。

3

T/CVMAXXXXX-2023

附錄A

（規(guī)范性）

腸炎沙門氏菌感染感染特異性檢測試劑制備方法

A.1培養(yǎng)

對照試劑SE1H和檢測試劑SE1H-SE菌株于37℃液體LB中，220rpm震蕩培養(yǎng)16h；

A.2收獲和滅活

用4℃離心機4000rpm離心5min，離心后用0.4%甲醛PBS重懸并洗滌3次，最后一

次重懸后放入4℃冰箱滅活24h；

A.3質(zhì)檢

將上述對照系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)的凝集檢測抗原利用本標準“5.1對照試驗”所述方法進行

有效性驗證，驗證成功方可進一步應(yīng)用。

4

T/CVMAXXXXX-2023

附錄B

（資料性）

試劑制備

B.1磷酸鹽緩沖液（PBS）

B1.1成分

氯化鈉8.0g

氯化鉀0.2g

十二水磷酸氫二鈉2.9g

磷酸二氫鉀0.2g

超純水1000mL

pH7.4±0.2

B.1.2制備方法

將上述成分依次