《水禽腸炎沙門氏菌感染感染特異性抗體檢 測(cè)方法 間接凝集法》

ICS11.220

B41

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXXXXX—2023

水禽腸炎沙門氏菌感染感染特異性抗體檢

測(cè)方法間接凝集法

Detectedmethodforinfectiousspecificantibodiesagainstwaterfowl

SalmonellaEnteritidisinfection--indirectagglutinationmethod

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

T/CVMAXXXXX-2023

水禽腸炎沙門氏菌感染特異性抗體快速檢測(cè)技術(shù)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水禽腸炎沙門氏菌感染特異性抗體檢測(cè)的試劑與材料、操作步驟和判定方

法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于水禽腸炎沙門氏菌感染的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T1962.1注射器、注射針頭及其他醫(yī)療器械第1部分：通用要求

GB15810一次性使用無(wú)菌注射器

GB/T17999.4SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)第4部分：SPF雞血清平板凝集試驗(yàn)

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T2838禽沙門氏菌病診斷技術(shù)

3術(shù)語(yǔ)和定義

3.1

惰性載體genericinertcarrier

泛性型惰性載體SE1H是為實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快速檢測(cè)抗原或感染抗體的間接凝集試驗(yàn)檢測(cè)而開

發(fā)的專利載體系統(tǒng)（專利號(hào)：ZL202010428277.X），能在較高的工作濃度下與不同遺傳背

景的人、畜禽、野生動(dòng)物等來(lái)源的血清、全血不發(fā)生任何肉眼可見的凝集顆粒反應(yīng)，即與上

述來(lái)源的血清、全血不產(chǎn)生非特異性凝集反應(yīng)。

3.2

對(duì)照試劑controlreagent

為消除血清學(xué)試驗(yàn)的假陽(yáng)性反應(yīng)，需要將每一份血清樣品與較高工作濃度的泛性型惰性

載體SE1H懸液進(jìn)行凝集測(cè)試，該泛性型惰性載體S9H懸液稱為對(duì)照試劑。

3.3

腸炎沙門氏菌檢測(cè)試劑testingreagentforSalmonellaEnteritidis

腸炎沙門氏菌檢測(cè)試劑是一種可用于檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和診斷腸炎沙門氏菌感染的新型專利檢

測(cè)系統(tǒng)。檢測(cè)試劑的研發(fā)基于泛性惰性載體SE1H攜帶腸炎沙門氏菌抗原因子（SE），并且

表面展呈表達(dá)單一SE抗原因子。該試劑能夠特異性靶向腸炎沙門氏菌感染產(chǎn)生的抗體，與腸

炎沙門氏菌感染的人和畜禽、野生動(dòng)物血清在工作濃度條件下產(chǎn)生肉眼可見的陽(yáng)性凝集顆粒

反應(yīng)，而與非腸炎沙門氏菌感染的不同背景和來(lái)源的人、畜禽、野生動(dòng)物等血清不出現(xiàn)非特

異性交叉凝集反應(yīng)。

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4試劑與材料

4.1試劑

4.1.1診斷試劑：對(duì)照試劑SE1H、腸炎沙門氏菌檢測(cè)試劑SE1H-SE，制備方法見附錄

A。

4.1.2腸炎沙門氏菌陰性對(duì)照血清（鴨源），由揚(yáng)州大學(xué)制備、鑒定和保存。

4.1.3腸炎沙門氏菌陽(yáng)性對(duì)照血清（鴨源），由揚(yáng)州大學(xué)制備、鑒定和保存。

4.1.4磷酸鹽緩沖溶液（PBS），見附錄B。

4.2材料

4.2.1透明玻璃板或玻片（26mm×76mm×2mm）。

4.2.2無(wú)菌吸頭。

4.3器械

4.3.11mL一次性無(wú)菌注射器（帶針頭），符合GB15810，GB/T1962.1標(biāo)準(zhǔn)要求。

4.3.25μL-50μL微量移液器。

5試驗(yàn)步驟

5.1對(duì)照試驗(yàn)

5.1.1每次檢測(cè)前20min從4℃冰箱中取出腸炎沙門氏菌陽(yáng)性對(duì)照血清、腸炎沙門氏菌陽(yáng)

性對(duì)照血清和無(wú)菌PBS，使其恢復(fù)至室溫（20℃-25℃）。用微量移液器吸取充分混勻的對(duì)

照抗原和診斷抗原各10μL，垂直滴加在潔凈玻璃板或玻片上，然后迅速分別滴加同量的陽(yáng)

性血清和陰性血清和無(wú)菌PBS，用吸頭混合均勻，涂布成長(zhǎng)1.5cm、寬0.5cm的片狀，隨后

不斷搖動(dòng)玻璃板或玻片，并于2min內(nèi)判定結(jié)果，無(wú)需靜置

5.1.2對(duì)照試驗(yàn)成立條件：2min內(nèi)腸炎沙門氏菌陽(yáng)性對(duì)照血清與對(duì)照試劑不發(fā)生凝集反

應(yīng)，而與腸炎沙門氏菌檢測(cè)試劑出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性凝集顆粒反應(yīng)；陰性對(duì)照血清與對(duì)照試劑和

腸炎沙門氏菌檢測(cè)試劑均不發(fā)生凝集反應(yīng)。

5.1.3若對(duì)照試驗(yàn)不滿足成立條件，則說(shuō)明試劑失效，需更換試劑并再次進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

5.2血樣采集

5.2.1采血人員需經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，熟練掌握采樣技巧，并遵循嚴(yán)格的無(wú)菌操作規(guī)程。采血

人員到達(dá)禽場(chǎng)后，需嚴(yán)格遵守雞場(chǎng)的消毒防疫等相關(guān)規(guī)定，口罩、乳膠手套、防護(hù)帽、防護(hù)

服、防護(hù)鞋穿戴整齊后方可進(jìn)入現(xiàn)場(chǎng)。

5.2.2采血場(chǎng)所應(yīng)有充足的光線便于肉眼觀察判定現(xiàn)場(chǎng)的凝集顆粒反應(yīng)，建議夏季室溫保

持在25℃~28℃，冬季則在14℃~20℃。

5.2.3采血時(shí)用的注射器應(yīng)保持清潔干燥，要有足夠的強(qiáng)度維持操作，使用靈活且方便，

外包裝未破損，并在有效期內(nèi)使用。

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5.2.4采血一般采用翅靜脈采血法。采血時(shí)，助手側(cè)臥保定水禽，助手左手握住水禽雙腿，

右手握住雙翅，將水禽側(cè)放于地面。采血者用大拇指壓迫翅膀根部靜脈，使靜脈充分充血，

以方便采血操作。采血者用酒精棉球消毒翅靜脈區(qū)域后即可進(jìn)針，在距離靜脈怒張?zhí)幋蠹s0.3

cm處，使針管與近心端血管的夾角約為45°，將針頭的切口面向上進(jìn)針。針頭輕挑起表皮，

由表皮與肌肉之間的空隙，往血管的遠(yuǎn)心端方向推針前行至血管上面，再將針管與血管重疊

成一條直線刺入血管。進(jìn)針不宜過(guò)深，如刺穿血管，皮下很快血腫，采血失敗。稍稍將針頭

輕插進(jìn)血管，輕拉活塞，吸取0.2-0.5mL血液。采血完畢，用干棉球壓迫采血部位，勿用酒

精棉球。

5.3獲取血清樣品

將存有全血的注射器水平靜置于地面，靜置30-60min后輕輕拔出活塞，血凝塊會(huì)隨活塞

被拉出，注射器管中剩余的淡黃色清亮液體即為血清。

5.4樣品檢測(cè)

5.4.1用微量移液器吸取充分混勻的對(duì)照試劑SE1H和腸炎沙門氏菌檢測(cè)試劑SE1H-SE各

10μL垂直滴加在玻板上，然后吸取等體積待檢血清，用吸頭混合均勻，涂布成長(zhǎng)1.5cm、

寬0.5cm的片狀，不斷輕輕地晃動(dòng)玻璃板或玻片，在2min之內(nèi)判定結(jié)果。

5.4.2檢測(cè)結(jié)束后遵守生物安全規(guī)則和無(wú)菌操作規(guī)則處理檢測(cè)樣品，檢測(cè)抗原使用后應(yīng)保

存在4℃。

5.5結(jié)果判定

5.5.1凝集試驗(yàn)陰性：2min內(nèi)血樣與對(duì)照試劑不反應(yīng)（混合底質(zhì)均勻一致，未出現(xiàn)凝集現(xiàn)

象），與檢測(cè)試劑也不反應(yīng)（見附錄C，圖C.1，陰性）。

5.5.2凝集試驗(yàn)弱陽(yáng)性：2min內(nèi)血樣與對(duì)照試劑不反應(yīng)，與檢測(cè)試劑出現(xiàn)輕微可見的細(xì)小

凝集顆粒，晃動(dòng)時(shí)有輕微滑動(dòng)（見附錄C，圖C.1，弱陽(yáng)性）。

5.5.3凝集試驗(yàn)陽(yáng)性：2min內(nèi)血樣與對(duì)照試劑不反應(yīng)，與檢測(cè)試劑出現(xiàn)明顯凝集塊，底質(zhì)

稍有渾濁（見附錄C，圖C.1，陽(yáng)性）。

5.5.4集試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性：2min內(nèi)血樣與對(duì)照試劑不反應(yīng)，與檢測(cè)試劑出現(xiàn)大的凝集塊，底質(zhì)

清亮（見附錄C，圖C.1，強(qiáng)陽(yáng)性）。

5.5.5當(dāng)凝集反應(yīng)結(jié)果為弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，可判定該只水禽為腸炎沙門氏菌感染。

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附錄A

（規(guī)范性）

腸炎沙門氏菌感染感染特異性檢測(cè)試劑制備方法

A.1培養(yǎng)

對(duì)照試劑SE1H和檢測(cè)試劑SE1H-SE菌株于37℃液體LB中，220rpm震蕩培養(yǎng)16h；

A.2收獲和滅活

用4℃離心機(jī)4000rpm離心5min，離心后用0.4%甲醛PBS重懸并洗滌3次，最后一

次重懸后放入4℃冰箱滅活24h；

A.3質(zhì)檢

將上述對(duì)照系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)的凝集檢測(cè)抗原利用本標(biāo)準(zhǔn)“5.1對(duì)照試驗(yàn)”所述方法進(jìn)行

有效性驗(yàn)證，驗(yàn)證成功方可進(jìn)一步應(yīng)用。

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附錄B

（資料性）

試劑制備

B.1磷酸鹽緩沖液（PBS）

B1.1成分

氯化鈉8.0g

氯化鉀0.2g

十二水磷酸氫二鈉2.9g

磷酸二氫鉀0.2g

超純水1000mL

pH7.4±0.2

B.1.2制備方法

將上述成分依次