DBS13 008-2017 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 肉及肉制品中沙門氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法

DBS13河北省衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布DBS13/008—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009規(guī)定的格式編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省衛(wèi)生和計劃生育委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)于2017年11月8日首次發(fā)布。2DBS13/008—2017食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)肉及肉制品中沙門氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法amplification，LAMP）檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于肉及肉制品中沙門氏菌的快速篩選檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢測總則GB4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測3原理根據(jù)沙門氏菌屬特有的靶序列invA基因設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引物和一對環(huán)引物，特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，利用BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在invA基因序列啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物；加入SYBRGreenI染料，即可通過顏色變化觀察判定結(jié)果。疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide，PMA)染料能夠嵌入細胞外DNA或者穿過非活性菌受損的細胞膜進入細胞進而嵌入其DNA內(nèi)，但被阻隔在活性菌的完整細胞膜之外。嵌入非活性菌DNA的PMA染料能夠在強光照射下通過疊氮基團與DNA進一步形成牢固的共價結(jié)合，使其不能在后續(xù)的LAMP反應(yīng)中擴增，因而可在LAMP反應(yīng)中消除來自于非活性菌的DNA對LAMP檢測結(jié)果的影響。4儀器和設(shè)備除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：4.1冰箱：2℃~5℃,-20℃;4.3均質(zhì)器；4.4振蕩器；4.5電子天平：感量0.1g；4.6二級生物安全柜；4.7高速臺式離心機：5000r/min~16000r/min；4.9微量移液器（0.1μL~2.5μL；0.5μL~10μL；20μL~200μL；100μL~1000μL）和吸頭；3DBS13/008—20174.10無菌透明離心管：1.5mL；4.11PCR反應(yīng)管（透明）；4.12水浴振蕩器：220r/min，37℃±1℃;4.13鹵素?zé)簦?00W。5試劑和材料除有特殊說明外，實驗所用試劑均為分析純或符合生化試劑標(biāo)準(zhǔn)；實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的要求。5.1緩沖蛋白胨水（BPW），見GB4789.4中A.1。5.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液，見GB4789.4中A.2。5.3亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液，見GB4789.4中A.3。5.4引物：根據(jù)沙門氏菌屬特有的靶序列invA基因設(shè)計一套特異性引物，見表1。表1特異性引物序列5’-CGGCCCGATTTTCTCTGG-5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-5’-GCGCGGCATCCGCATCAATA-TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3’5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCG5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’5’-GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG-5.510×BstDNA聚合酶緩沖液。5.6100mmol/LMgSO4。5.710mmol/LdNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）。5.8BstDNA聚合酶。5.9無菌去離子水。5.10PMA染料，20mM（1mgPMA添加98μL無菌去離子水制成溶液保存）。5.11SYBRGreenI染料，1000×（取1μL10000×SYBRGreenI染料，添加9μL無菌去離子水）。5.12本標(biāo)準(zhǔn)用做陽性對照的菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028標(biāo)準(zhǔn)菌株。6檢測程序檢測程序參見圖1。4DBS13/008—2017 樣品處理 25g樣品+225mLBPW36℃±1℃8h~18h1mL+TTB10mL1mL+SC10mL42℃±1℃18h~24h36℃±1℃18h~24hPMA的處理DNA模板的提取LAMP反應(yīng)結(jié)果觀察↓按照GB4789.4方法操作↓報告圖1檢驗程序7操作步驟7.1前增菌按GB4789.4中5.1操作。7.2增菌按GB4789.4中5.2操作。7.3PMA的處理吸取增菌后的1mLSC和1mLTTB分別加入1.5mL無菌透明離心管中，各加入100μLPMA溶液，220r/min振蕩，37℃±1℃避光保溫10min。然后將離心管進行冰浴，同時置于500W鹵素?zé)粽路剑嗑?0cm~15cm，曝光10min。7.4DNA模板的制備根據(jù)實驗室實際情況，可采用方法一或方法二制備DNA模板：5DBS13/008—2017a)方法一（熱裂解法從7.3中PMA處理過的SC和TTB增菌液中各取1mL分別放入另一1.5mL無菌透明離心管中，10000r/min離心2min，棄上清；加入滅菌生理鹽水1mL混勻，10000r/min離心2min，棄上清；然后加無菌去離子水100μL混勻，置100℃煮沸5min，10000r/min離心2min，取上清即為DNA模板，放置-20℃保存，備用。b)方法二（試劑盒法7.3中PMA處理過的SC和TTB增菌液分別參照商品化試劑盒產(chǎn)品操作程序提取DNA模板。7.5LAMP反應(yīng)7.5.1反應(yīng)體系配制：分別采用7.4中SC和TTB增菌液提取的DNA模板，將沙門氏菌LAMP檢測的反應(yīng)體系中各試劑依次添加到PCR反應(yīng)管中。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進行相應(yīng)調(diào)整。反應(yīng)體系見表2。表2沙門氏菌LAMP檢測的反應(yīng)體系體積(μL）8000U/mLBstDNA聚合酶— 7.5.2反應(yīng)程序：將反應(yīng)管中的反應(yīng)體系混勻，置于63℃擴增40min，再置于80℃保溫10min，終止反應(yīng)。7.5.3對照：檢驗過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。以鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028純培養(yǎng)物提取的DNA模板為陽性對照，以非沙門氏菌純培養(yǎng)物提取的DNA模板為陰性對照，以無菌去離子水代替DNA模板為空白對照。7.6結(jié)果觀察LAMP反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)于2min內(nèi)在反應(yīng)管加入1000×SYBRGreenI染料lμL，輕輕混勻，立即觀察顏色變化。8結(jié)果判定和報告在空白對照和陰性對照反應(yīng)管液體顯示為橙色，陽性對照反應(yīng)管液體顯示為黃綠色的條件下：8.1陽性：若SC或TTB任一增菌液的反應(yīng)結(jié)果顯示為黃綠色，則判定25g樣品中沙門氏菌初篩結(jié)果為陽性，應(yīng)按照GB4789.4方法繼續(xù)進行5.3分離、5.4生化試驗和5.5血清學(xué)鑒定