免疫學檢測技術2講課文檔

免疫學檢測技術第一頁，共八十八頁。優(yōu)選免疫學檢測技術第二頁，共八十八頁。一.體外抗原抗體反應的特征

高度特異性：抗原的表位與抗體的抗原結合點結構互補。

表面化學基團之間的可逆性結合適宜的抗原抗體濃度和比例抗原抗體反應的兩個階段第三頁，共八十八頁。高度專一性的結合第四頁，共八十八頁。可逆性結合Equivalence–Latticeformation第五頁，共八十八頁?？乖贵w比例對反應現(xiàn)象的影響第六頁，共八十八頁?？乖贵w反應的影響因素電解質：可促進抗原與抗體的結合。常用生理鹽水。溫度：最適溫度為37℃。酸堿度：最適pH=6-8。第七頁，共八十八頁。第二節(jié)檢測抗原或抗體的體外試驗第八頁，共八十八頁。（一）凝集反應顆粒性抗原（RBC、細菌等）與相應抗體結合形成肉眼可見凝集物的現(xiàn)象或反應。1．直接凝集試驗玻片凝集試驗：用于定性測抗原。如ABO血型鑒定，細菌的鑒定、分型等。試管凝集試驗：用于定量測抗體，如肥達氏反應。

2．間接凝集試驗如類風濕因子的測定等。第九頁，共八十八頁。第十頁，共八十八頁。（二）沉淀反應

可溶性抗原（血清蛋白、組織浸液等）與相應抗體結合而形成可見沉淀物的反應。因該類反應多在半固體瓊脂凝膠中進行，故又稱為瓊脂擴散試驗或免疫擴散。

第十一頁，共八十八頁。瓊脂凝膠第十二頁，共八十八頁。1．單向免疫擴散用于定量測抗原。如檢測血清免疫球蛋白、C3等含量。

第十三頁，共八十八頁。2．雙向免疫擴散主要用于定性檢測抗原或抗體，抗原組成及兩種抗原相關性分析第十四頁，共八十八頁。3．免疫電泳

其方法是先電泳、后擴散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于診斷如骨髓瘤、性聯(lián)低丙種球蛋白血癥等的診斷

第十五頁，共八十八頁。（三）免疫標記技術免疫標記技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術第十六頁，共八十八頁。常用的標記物酶、熒光素、放射性核素、化學發(fā)光物質及膠體金優(yōu)點：極大的提高了反應的靈敏度，可以對微量物質進行定量、定性或定位檢測。免疫標記技術主要類型：免疫酶技術免疫熒光技術放射免疫測定法發(fā)光免疫分析免疫膠體金技術第十七頁，共八十八頁。1)免疫酶測定法（EnzymeImmunoassay,EIA）利用酶標記一抗或二抗檢測特異性抗原或抗體的方法特點：利用抗原-抗體反應的高度特異性，以及酶催化底物反應的生物放大作用,最后用酶標儀測定光密度值（OD），評定抗原-抗體的含量。第十八頁，共八十八頁。常用酶及其底物辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）

第十九頁，共八十八頁。分類第二十頁，共八十八頁。雙抗體夾心法在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等第二十一頁，共八十八頁。特點：非競爭結合反應常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇

第二十二頁，共八十八頁。間接法ELISA乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法第二十三頁，共八十八頁。2)免疫熒光技術

(ImmunofluorescenceTechnique)

用熒光素標記一抗或二抗，檢測特異性抗原或抗體的方法

第二十四頁，共八十八頁。常用熒光素異硫氰酸熒光素（FITC），顯黃綠色。藻紅蛋白（PE），顯紅色。用途：細胞表面CD分子抗核抗體

第二十五頁，共八十八頁。第二十六頁，共八十八頁。第二十七頁，共八十八頁。第二十八頁，共八十八頁。3)放射免疫測定法（RIA）用放射性核素標記一抗或二抗，檢測特異性抗原或抗體的方法敏感度可達pg水平，其標記物為125I、131I等。常用于微量物質的檢測，如激素、IgE等。

第二十九頁，共八十八頁。4)發(fā)光免疫分析(luminescenceimmunoassay

LIA)將發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測定相結合而建立的一種新的超微量免疫分析技術。優(yōu)點：該方法既具有免疫反應的高度特異性又有發(fā)光分析的高靈敏度。第三十頁，共八十八頁?；瘜W發(fā)光免疫測定吖啶酯、魯米諾生物發(fā)光免疫測定螢火蟲、發(fā)光水母化學發(fā)光酶免疫測定辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）電化學發(fā)光免疫測定第三十一頁，共八十八頁。5)免疫膠體金技術用膠體金標記一抗或二抗，檢測特異性抗原或抗體的方法第三十二頁，共八十八頁。6)免疫印跡法（Westernblotting）該法是將凝膠電泳與固相免疫相接合的檢測技術，即將電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫技術測定。常用于檢測多種蛋白質第三十三頁，共八十八頁。免疫印跡法示意圖第三十四頁，共八十八頁。第三十五頁，共八十八頁。4.蛋白質芯片技術：又稱蛋白質微陣列是一種高通量的蛋白功能分析技術，可用于蛋白質表達譜分析，研究蛋白質與蛋白質的相互作用，甚至DNA－蛋白質、RNA－蛋白質的相互作用，篩選藥物作用的蛋白靶點等。第三十六頁，共八十八頁。原理：是將各種蛋白質有序地固定于載玻片等各種介質載體上成為檢測的芯片，然后，用標記了有特定熒光物質的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質相匹配的抗體將與其對應的蛋白質結合，抗體上的熒光將指示對應的蛋白質及其表達數(shù)量。第三十七頁，共八十八頁。第三節(jié)免疫細胞功能的檢測第三十八頁，共八十八頁。第三十九頁，共八十八頁。免疫細胞的分離外周血單個核細胞分離淋巴細胞的分離T細胞和B細胞的分離T細胞亞群的分離第四十頁，共八十八頁。(一)外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）包括淋巴細胞和單核細胞（monocyte）。

Ficoll分離液法主要用于分離外周血中的單個核細胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。第四十一頁，共八十八頁。細胞分離基本原理不同細胞密度不同不同細胞表面生物學特性不同不同細胞表面分化抗原不同第四十二頁，共八十八頁。不同細胞密度不同人的紅細胞密度為1.093

粒細胞密度為1.092單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）的密度為1.075-1.090

第四十三頁，共八十八頁。用1.077±0.001的分層液可將細胞分離第四十四頁，共八十八頁。密度梯度離心(Ficoll)離心第四十五頁，共八十八頁。（二）淋巴細胞及其亞群的分離和分析免疫吸附分離法免疫磁珠法熒光激活細胞分離儀分離法（

(FluorescenceActivatedCellSorting)，

FACS

）抗原肽-MHC分子四聚體技術分析CTL

第四十六頁，共八十八頁。2.免疫磁珠細胞分離第四十七頁，共八十八頁。第四十八頁，共八十八頁。免疫磁珠法細胞分選過程第四十九頁，共八十八頁。3.熒光激活細胞分離儀分離法流式細胞術(flowcytometry,FCM)

第五十頁，共八十八頁。全自動細胞分選系統(tǒng)第五十一頁，共八十八頁。流式細胞分析儀第五十二頁，共八十八頁。流式細胞儀的工作原理和基本結構待測細胞以單個細胞的懸液，經特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。流動室充滿IsoFlow

，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料被激發(fā)產生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。第五十三頁，共八十八頁。4.抗原肽-MHC分子四聚體是一種藥品的名字，可應用于免疫學研究和檢測、特異性免疫治療以及疫苗療效監(jiān)測等多個方面第五十四頁，共八十八頁?？乖?MHC分子四聚體技術分析CTL第五十五頁，共八十八頁。二細胞免疫功能檢測T細胞功能測定B細胞功能測定第五十六頁，共八十八頁。（1）T淋巴細胞增殖試驗原理：淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質疏松第五十七頁，共八十八頁。1）形態(tài)學檢查法第五十八頁，共八十八頁。2）3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。缺點：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。第五十九頁，共八十八頁。3H-TdR或125I-UdR摻入法第六十頁，共八十八頁。3）MTT比色法第六十一頁，共八十八頁。(2)遲發(fā)型超敏反應檢測第六十二頁，共八十八頁。2.B細胞功能測定單擴ELISA速率比濁法測定各類免疫球蛋白含量抗體形成細胞測定第六十三頁，共八十八頁。（2）溶血空斑試驗原理：第六十四頁，共八十八頁。臨床應用與評價溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體產生抗體的能力。

第六十五頁，共八十八頁。

B細胞抗體形成功能的檢測

——酶聯(lián)免疫斑點法原理：第六十六頁，共八十八頁。應用與方法學評價：該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。第六十七頁，共八十八頁。ELISPOT技術簡介

酶聯(lián)免疫斑點試驗(Enzymelinkedimmunospotassay)

80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內外廣泛應用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。第六十八頁，共八十八頁。ELISPOT的基本原理

細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與酶標記（例如堿性磷酸酶）的親和素結合。底物（BCIP/NBT，產物為藍紫色）孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點分析后得出結果。第六十九頁，共八十八頁。穩(wěn)定、特異，且抗原用量少可同時檢測不同抗原誘導的抗體分泌，并可定量檢測可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞ELISPOT檢測抗體分泌第七十頁，共八十八頁。ELISPOT分析系統(tǒng)酶聯(lián)斑點讀板儀第七十一頁，共八十八頁。3.細胞毒試驗原理：靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞第七十二頁，共八十八頁。淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力

（1）51Cr釋放法第七十三頁，共八十八頁。圖15-2T細胞細胞毒試驗示意圖第七十四頁，共八十八頁。（2）乳酸脫氫酶釋放法第七十五頁，共八十八頁。第七十六頁，共八十八頁。（3）細胞染色法第七十七頁，共八十八頁。第七十八頁，共八十八頁。(4)凋亡細胞檢測法細胞凋亡生理性凋亡病理性凋亡由遺傳控制，受既定程序（或基因）調控的，是程序性的細胞死亡（programmedcelldeath,PCD）非遺傳控制的的意外的細胞壞死（accidentalcelldeath）定義：凋亡定義：細胞壞死第七十九頁，共八十八頁。細胞壞死（細胞被動性死亡）細胞受到急性強力傷害時，立即出現(xiàn)的早期反應。是病理條件下細胞死亡的過程。細胞腫脹，線粒體和內質網腫脹核染色質隨機降解呈絮狀,蛋白合成減少。細胞膜、溶酶體破裂,細胞內容物流出,引起周圍炎癥細胞凋亡（細胞主動性死亡）多細胞有機體為調控機體發(fā)育、維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞主動性死亡過程。又稱程序性細胞死亡(programmedcelldeath,PCD).

從嚴格的詞學意義上來說，PCD與凋亡是有很大區(qū)別的第八十頁，共八十八頁。細胞壞死細胞凋亡第八十一頁，共八十八頁。細胞凋亡檢測方形態(tài)學方法電泳法原位缺口末端標記法流式細胞術測定法第八十二頁，共八十八頁。形態(tài)學方法

細胞壞死細胞凋亡第八十三頁，共八十八頁。電泳法在細胞凋亡時，內源性mg2+、ca2+依賴性核算內切酶被激活，對DNA的切割有3種形式。即核小體間DNA鏈的斷裂、大分子DNA鏈的斷裂以及DNA單鏈的斷裂。瓊脂糖凝膠電泳時，可觀察到特征的‘梯狀’（ladder）DNA條帶第八十四頁，共八十八頁。TdT-mediat