《藥品微生物菌種管理技術(shù)規(guī)范》

ICS11.120.01

CCSC27

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/HZBXXXXX—2024

藥品微生物菌種管理技術(shù)規(guī)范

Practicesfordrugmicrobiome

（征求意見(jiàn)稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

惠州市標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)發(fā)布

T/HZBXXXXX—2024

藥品微生物菌種管理技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)室菌種的購(gòu)進(jìn)、復(fù)活、確認(rèn)、保藏、使用、銷(xiāo)毀、記錄等內(nèi)容。

本文件適用于藥品微生物限度檢查、無(wú)菌檢查的菌種處理和保藏。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.28-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

《中國(guó)藥典》2020年版四部

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

標(biāo)準(zhǔn)菌株referencestraine

來(lái)自于國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯，并至少定義到屬或種水

平的菌株。

商業(yè)派生菌株Commerciallyderivedstrain

由標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物，來(lái)自于其它供應(yīng)商，所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效，具有可溯源性的菌株，

分為定性商業(yè)派生菌株和定量商業(yè)派生菌株。商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株referencereservestrain

標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)活后，再轉(zhuǎn)種至適宜的培養(yǎng)基生長(zhǎng)，重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性，即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。標(biāo)

準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備下一代標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株或工作菌株。

工作菌株Workingstrain

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株轉(zhuǎn)種至適宜的培養(yǎng)基生長(zhǎng)，即為工作菌株。工作菌株一般不用來(lái)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

代數(shù)algebra

從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代。1代是指將活的培養(yǎng)物接種到微生物生長(zhǎng)的新鮮培養(yǎng)基

中培養(yǎng)，任何形式的轉(zhuǎn)種均被認(rèn)為是傳代1次。

4菌種購(gòu)進(jìn)

標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)。商業(yè)派生菌株應(yīng)來(lái)自能提供溯源性報(bào)告和菌種

證明，保證其溯源性以及與標(biāo)準(zhǔn)菌株的等效性的生產(chǎn)廠家。

5菌種復(fù)活

1

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使處于休眠狀態(tài)的菌種恢復(fù)其生物特征，也稱(chēng)為復(fù)蘇。通常接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）

中適宜時(shí)間進(jìn)行復(fù)活，或按供應(yīng)商提供的說(shuō)明。

6菌種確認(rèn)和保藏

復(fù)壯

標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)活后，再轉(zhuǎn)種至適宜的培養(yǎng)基生長(zhǎng)，使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性。

復(fù)壯后的菌種方可用于進(jìn)行確認(rèn)。

定期確認(rèn)

驗(yàn)證菌株的特性和純度，可檢查微生物形態(tài)、革蘭氏染色或用生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定。

保藏

標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過(guò)復(fù)壯、確認(rèn)符合要求后，即可作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株用于保藏。

可將培養(yǎng)物等份懸浮于抗冷凍的培養(yǎng)基中并分裝于小瓶中，采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫

冷凍（低于-30℃）等方法保藏。

冷凍的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后，不得重新冷凍或再次使用。

7菌種使用

工作菌株可用于制備菌懸液。

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌：取工作菌

株新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度，即為菌懸液。

黑曲霉：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株轉(zhuǎn)種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面，20℃～25℃培養(yǎng)

至獲得豐富的孢子，加入適量稀釋劑（含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

或含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液），將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢

子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用稀釋劑制成適宜濃度，即為菌懸液。

8銷(xiāo)毀

廢棄菌株的銷(xiāo)毀應(yīng)符合GB19489的要求。

9記錄

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立菌種管理的文件和記錄，內(nèi)容包括菌株的購(gòu)進(jìn)、轉(zhuǎn)種、確認(rèn)、使用、銷(xiāo)毀全過(guò)程。

2

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A

A

附錄A

（資料性）

標(biāo)準(zhǔn)菌株到菌懸液工作流程

A.1圖A.1給出了從標(biāo)準(zhǔn)菌株到菌懸液工作流程。

圖A.1標(biāo)準(zhǔn)菌株到菌懸液工作流程圖

B

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3

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附錄B

（資料性）

實(shí)驗(yàn)室常用的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株保藏方法

B.1瓊脂斜面低溫保藏法

用接種環(huán)挑取少量純菌從斜面底部培養(yǎng)基（不要穿進(jìn)斜面底部培養(yǎng)基中）表面劃線，按規(guī)定的溫度

和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種管用牛皮紙包好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保

藏時(shí)間，可將菌種保藏管塞換成無(wú)菌橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏，每隔2～3個(gè)月轉(zhuǎn)接一次，繼

續(xù)進(jìn)行保藏。

銅綠假單胞菌在10℃以下易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜在冰箱中保藏。

B.2甘油冷凍管保藏法

將待保藏菌接種于瓊脂斜面上，在適宜的溫度培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，加入無(wú)菌蒸餾水，用無(wú)菌接種

環(huán)輕輕刮取菌苔，制成菌懸液，在菌懸液中加入等體積無(wú)菌的含20%甘油的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）

溶液，輕輕振搖試管，使內(nèi)容物充分混勻，分裝無(wú)菌小管，置-80℃～-20℃貯存（1～5年）。在不高

于-70℃低溫冷凍保存可延長(zhǎng)保藏時(shí)間。

B.3磁珠保藏法

將待保藏菌接種于瓊脂斜面上，在適宜的溫度培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的菌落，接入磁珠保藏管中

（通常需要接入4-7環(huán)，對(duì)于苛養(yǎng)菌應(yīng)多接一些），擰上蓋子，充分均勻搖晃后用無(wú)菌吸管吸走溶液，

盡可能吸干，然后置-80℃～-20℃貯存。在不高于-70℃低溫冷凍保存可延長(zhǎng)保藏時(shí)間。

具體操作可按磁珠保藏管廠家說(shuō)明書(shū)。

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C

C

附錄C

（資料性）

微生物限度檢查常用菌懸液制備

C.1金黃色葡萄球菌

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的甘油冷凍管，解凍后吸0.5mL轉(zhuǎn)種至10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，32.5℃

培養(yǎng)24h，以10倍稀釋或100倍稀釋步驟稀釋至10-7，菌懸液濃度102～103cfu/mL。

C.2大腸埃希菌

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的甘油冷凍管，解凍后吸0.5mL轉(zhuǎn)種至10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，32.5℃

培養(yǎng)24h，以10倍稀釋或100倍稀釋步驟稀釋至10-7，菌懸液濃度102～103cfu/mL。

C.3銅綠假單胞菌

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的甘油冷凍管，解凍后吸0.5mL轉(zhuǎn)種至10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，32.5℃

培養(yǎng)24h，以10倍稀釋或100倍稀釋步驟稀釋至10-7，菌懸液濃度102～103cfu/mL。

C.4沙門(mén)氏菌

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的甘油冷凍管，解凍后吸0.5mL轉(zhuǎn)種至10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，32.5℃

培養(yǎng)24h，以10倍稀釋或100倍稀釋步驟稀釋至10-6，菌懸液濃度102～103cfu/mL。

C.5白色念珠菌

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的甘油冷凍管，解凍后吸0.5mL轉(zhuǎn)種至1