分子生物學實驗設計課件

2011級本科生化及分子生物學實驗設計年級、專業(yè)、班級：2010級臨床二大班實驗課時間：2010年4月25日實驗室：第四實驗室組別：第四組組員排名：PPT制作及演講（屈再蕊、古怡）資料查找（樓昕、蔣安罡）報告人：古怡、屈再蕊分子生物學實驗設計實驗名稱高鐵血紅蛋白還原實驗實驗目的掌握高鐵血紅蛋白還原實驗的操作及步驟了解G6PD的活性檢測分子生物學實驗設計實驗原理正常紅細胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖轉變?yōu)?磷酸葡萄糖酸，同時又能使其輔酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)還原為還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，高鐵血紅蛋白在NADPH供氫條件下還原成還原血紅蛋白。氧化型亞甲基藍可作為遞氫體加速磷酸戊糖旁路代謝中此種作用的速度，當G6PD缺乏時，在遞氫體亞甲基藍加速磷酸戊糖旁路的條件下，高鐵血紅蛋白還原速度顯著降低，因此，可根據(jù)高鐵血紅蛋白還原的速度來了解紅細胞有無G6PD缺乏。分子生物學實驗設計G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），在遇到蠶豆中某種因子后更誘發(fā)了紅細胞膜被氧化，紅細胞膜上的磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質，損害細胞膜。G-6-PD有保護正常紅細胞免遭氧化破壞的作用，新鮮蠶豆是很強的氧化劑，當G-6-PD缺乏時則紅細胞被破壞而致病。亞甲基藍與血紅蛋白結合能力強亞硝酸鈉能使血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白還原試驗意義當紅細胞G-6-PD活性正常時，還原率>75%；如G-6-PD缺陷，形成高鐵血紅蛋白，還原速度遠較正常紅細胞慢，還原率顯著降低。分子生物學實驗設計實驗試劑高鐵血紅蛋白還原試驗法試劑?(自制，有效期內(nèi)使用)：0．18mo]／1亞硝酸鈉一0．28mol／I葡萄糖溶液(亞硝酸鈉1．25g，葡萄糖5．og，加蒸餾水至100mL，貯存于棕色瓶中，放4℃冰箱．可保存1個月)0．4mmol／I亞甲基藍溶液(先將0.15g含3個結晶水的亞甲基藍放入乳缽中，加蒸餾水少量研磨，待溶解后移到100mL容量瓶中．再加蒸餾水至100mL，混勻過濾，此液可貯存3個月)、生理鹽水、蒸餾水。分子生物學實驗設計實驗儀器抗凝管、紫外分光光度儀、離心機、試管、恒溫水浴箱。分子生物學實驗設計實驗步驟1將抗凝血以1000r／min離心沉淀15min，取出．調(diào)整血細胞與血漿比側為1：l后再混勻。2將0．18mol／L亞硝酸鈉一0．28mol／L葡萄糖溶液與0．4mmol／L亞甲基藍溶液等量混合．形成混合試劑3取15mm×150mm試管3支，標明A、B、S，按表1順序進行操作表1高軼血紅蛋白還原試驗操作步驟分子生物學實驗設計ABC混合試劑/ml0.01__生理鹽水/ml_0.01_0.18mol/l亞硝酸鈉,-0.28mol/l葡萄糖溶液__0.01分子生物學實驗設計經(jīng)調(diào)整的全血/ml0.10.10.1來回搖動15-20次,置37℃水浴箱靜置3h蒸餾水／mL10.0010.0010.00分子生物學實驗設計4顛倒混勻，以“B”管為空白管，在波長635nm處測定“A”管及“S”管吸光度。5高鐵血紅蛋白還原率(MHb%)=(1一A／S)×100，MHb%在31～74之間(中間值，雜合子)或≤30(純臺子)，即為G6PD活性缺乏，均判斷為陽性。MHb%≥75，則為G6PD活性正常，判斷為陰性。分子生物學實驗設計實驗結果朗伯比爾定律A=lg（1/T）=Kbc（A-吸光度，T-透射比，K-摩爾吸收系數(shù)，c-吸光物質的濃度，b-收層厚度）高鐵血紅蛋白還原率(MHb%)=(1一A／S)×100，MHb%在31～74之間(中間值，雜合子)或≤30(純臺子)，即為G6PD活性缺乏，均判斷為陽性。MHb%≥75，則為G6PD活性正常，判斷為陰性。分子生物學實驗設計思考題1.根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初步判斷患兒是何種疾??？（必答）面色蒼白——貧血伴血尿——血紅蛋白尿惡心、嘔吐——說明有溶血性貧血尿呈醬油色——蠶豆病典型體征姐姐有過類似情況——符合蠶豆病具有遺傳性這一特點分子生物學實驗設計相關知識蠶豆病是由于遺傳性紅細胞六磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD酶)缺乏者進食蠶豆后，隨后發(fā)生的急性溶血性疾病。通過性聯(lián)不全顯性遺傳，G-6-PD基因在X染色體上，病人大多為男性，男女之比約為7∶1，在生吃蠶豆后數(shù)小時至數(shù)日（1～3天）內(nèi)突然發(fā)熱、頭暈、煩躁、惡心，尿呈醬油樣或葡萄酒色，一般發(fā)作2～6天后能自行恢復，但重者若不及時搶救，會因循環(huán)衰竭危及生命。分子生物學實驗設計3.從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果。（必答）蠶豆病遺傳性葡萄糖-6磷-酸脫氫酶急性溶血性貧血分子生物學實驗設計1，G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），在遇到蠶豆中某種因子后更誘發(fā)了紅細胞膜被氧化，紅細胞膜上的磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質，損害細胞膜發(fā)生溶血。故臨床表現(xiàn)為黃疸，精神萎靡，低熱。溶血嚴重發(fā)生心力衰竭，造成食欲不振、惡心、嘔吐這些臨床癥狀，心衰最典型的癥狀是程度不同的呼吸困難，所以病人呼吸急促。分子生物學實驗設計2，還原型谷胱甘肽（GSH）是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以保護一些含—SH(氫硫基)的蛋白質或酶免受氧化劑尤其是過氧化物的損害。因G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），高鐵血紅蛋白還原成血紅蛋白降低。3，高鐵血紅蛋白還原率(MHb%)在31～74之間(中間值，雜合子)或≤30(純臺子)，即為G6PD活性缺乏，均判斷為陽性。MHb%≥75，則為G6PD活性正常，判斷為陰性。分子生物學實驗設計

4,急性溶血性貧血起病急驟、可突發(fā)寒戰(zhàn)、高熱、面色蒼白、腰酸背痛、氣促、乏力、煩躁、亦可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛等胃腸道癥狀。這是由于紅細胞大量破壞，其分解產(chǎn)物對機體的毒性作用所致。游離血紅蛋白在血漿內(nèi)濃度加深時，即由尿液排出，出現(xiàn)血紅蛋白尿，尿色如濃紅茶或醬油樣，12小時后可出現(xiàn)黃疸，溶血產(chǎn)物損害腎小管細胞，引起壞死和血紅蛋白沉積于腎小管，以及周圍循環(huán)衰弱等因素，可致急性腎功能衰竭。分子生物學實驗設計4.要想探討該病發(fā)生的分子基礎，可以用哪些技術檢測什么目的基因？（選答）1.PCR，利用PCR技術由變性--退火--延伸三個基本反應步驟，擴增葡萄糖6磷酸脫氫酶熱點基因片段。采用單鏈構象多態(tài)性（SSCP）技術對擴增片段進行分析。用PCR直接測序以確定突變的基因位點檢測X染色體內(nèi)G6PD的基因及擴增其因.分子生物學實驗設計5.患者體型瘦小與該病癥是否有關，為什么？（選答）

無關，體型瘦小跟先天遺傳有一點關系，但是后天性的運動跟營養(yǎng)更重要。有蠶豆病不一定就瘦小。蠶豆病不能吃蠶豆