藥品生物檢定的基本概念和任務-生物檢定用儀器分析技術

色譜分析技術

1906年，俄國植物學家Tsweet將CaCO3固體粉末裝入豎立的玻璃管中，從頂端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚連續(xù)地沖洗。結果在柱中出現(xiàn)了顏色不同的色帶。因此，Tsweet把這種方法稱為色譜法。如今，色譜法不僅用于有色物質的分離，而且大量用于無色物質的分離。所以色譜法已經(jīng)失去原來的含義。但是，現(xiàn)在仍沿用色譜法這個名稱。色譜法具有分離及分析兩種功能。它是分析混合物最有力的手段。色譜分離是目前應用最廣泛的分離方法。已廣泛地用于石油化工、有機合成、生理生化、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測、刑事偵查、生產(chǎn)在線控制，乃至空間探索等許多領域，以解決各種分離分析課題。什么是色譜法？

色譜法是一種分離、分析方法，有時又稱為層析技術。它利用被分離的諸物質在互不相溶的兩相中分配系數(shù)等的微小差異進行分離。當兩相作相對移動時，使被測物質在兩相之間進行反復多次分配，使原來微小的差異累加產(chǎn)生了很大的效果，形成差速遷移，使各組分在柱內(nèi)移動的同時逐漸分離，以達到分離、分析及測定一些物理化學常數(shù)的目的。

兩種組分的理化性質原本存在著微小的差異，經(jīng)過反復多次地吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程使微小差異累積起來，結果使吸附能力弱的組分先流出色譜柱，吸附能力強的組分后流出色譜柱，從而使各個組分得到了分離。吸附→解吸→再吸附→再解吸色譜過程對復雜混合物各組分進行定量和定性分析色譜法的特點1．分離效率高：可在很短的時間內(nèi)分離多達二、三百個組分的復雜物質，柱效能可達106的理論板。2．檢測能力強：可以檢測出10-11~10-15克級的痕量組分，能滿足環(huán)境檢測、農(nóng)藥殘留等大量日常檢測分析的需要。3．樣品用量少：樣品用量一般為微升級，少的可達納克級。4．適用范圍廣：幾乎所有與化學有關的領域都有其用武之地。色譜分類流動相與固定相聚集態(tài)色譜分類根據(jù)固定相的形狀：紙色譜、薄層色譜和柱色譜。根據(jù)分離操作方式：間歇色譜、連續(xù)色譜檢測器色譜檢測器是一個將組分濃度和量信息轉化為電信號的傳感器，信號的大小和組分的濃度或量成正比?，F(xiàn)用的液相色譜的檢測器分為兩種：①普通檢測器：它是測定流動相加人溶質后的某種物理性質的變化；②溶質性質或選擇性檢測器：它只對溶質的某些性質是靈敏的。液相色譜的主要檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和蒸發(fā)散射光檢測器等。檢測器檢測下限/(g/ml)線性范圍選擇性梯度淋洗主要特點UV-Vis10-10103～104有可對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很小；對溶質的響應變化大。熒光10-12～10-11103有可選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響電化學10-10103有困難選擇性高；易受流動相pH值和雜質的影響；穩(wěn)定性較差。蒸發(fā)光散射10-9無可可檢測所有物質。示差折光10-1104無不可可檢測所有物質；不適合微量分析；對溫度變化敏感。質譜10-10無可主要用于定性和半定量。氣相色譜氣相色譜法主要利用物質的沸點、極性及吸附性質的差異，以氣體為流動相，以液體或固體為固定相從而達到分離混合物的色譜方法。氣相色譜法的特點優(yōu)點：分離效率高、應用范圍寬、分析速度快、樣品用量少;

靈敏度高、分離和測定一次完成、自動化程度高.缺點：不適用于高沸點（>450℃）、有生物活性的物質的分離測定不適用于制備.待測樣品在高溫的氣化室氣化后在惰性氣體的帶動下進入色譜柱，色譜柱內(nèi)含有液體或固體固定相每種組分都傾向于在流動相和固定相之間形成分配或吸附平衡。但由于載氣是流動的，這種平衡實際上很難建立。由于載氣的流動，使樣品組分在運動中進行反復多次的分配或吸附、解吸。結果是在載氣中分配濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分后流出色譜柱，進入檢測器。甲醇和乙醇混合樣色譜圖高效液相色譜高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。高效色譜儀首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留的檢測笨和丙酮混合樣的色譜圖液相色譜的主要特點是：分離效率高；選擇性好，適用于多種多元組分復雜混合物的分離；應用范圍廣。從無機物到有機物，從天然物質到合成產(chǎn)物，從小分子到大分子，從一般化合物到生物活性物質等。離子交換色譜法——

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離。

例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子。因此，應用范圍較廣。主要色譜方法凝膠滲透色譜親和色譜分子印跡色譜技術色譜相關術語

試樣經(jīng)色譜柱獲得分離，按先后次序經(jīng)過檢測器時，檢測器就將流動相中各組分濃度變化轉變成電信號，由記錄儀記錄下信號—時間曲線，稱為色譜流出曲線或色譜圖。色譜相關術語由色譜流出曲線可直接得到的相關術語：基線色譜峰色譜時間由色譜流出曲線可間接得到的相關術語：色譜體積相對保留值基線(Baseline)

在色譜操作條件下，僅有流動相通過檢測器時，由記錄儀得到的信號—時間曲線?；€漂移：基線隨時間定向緩慢的變化。基線噪聲：由于各種原因引起的基線波動。不論有無組分流出，其噪聲均存在，它是一種背景信號。色譜峰(Chromatographicpeak)流動相帶著組分通過檢測器時，由記錄儀得到的信號—時間曲線。峰底(Peakbase)：從峰的起點到峰的終點之間連線。峰高(Peakhight)：峰的頂點至峰底的垂直距離,通常用h表示。峰面積（Peakarea）：峰與峰底之間的面積，用A表示。色譜峰區(qū)域寬度(Peakwidth)

是色譜流出曲線的一個重要參數(shù)，它直接反映了分離條件的好壞。習慣上有下面三種表示方法：1）標準偏差：峰高0.607處色譜峰寬度的一半,用σ表示。2）峰寬或基線寬度：通過峰兩側的拐點作切線與峰底相交的寬度，用Y表示。與標準偏差的關系為：Y=4σ。3）半峰寬：峰高一半處色譜峰的寬度,用Y1/2表示。與標準偏差的關系為：Y1/2=2σ(2ln2)1/2。色譜時間色譜時間主要有：死時間（Deadtime）：不被固定相吸附或溶解的惰性組分，從進樣到出峰的峰頂點之間測得的時間,用tM表示。保留時間（Retentiontime）：從進樣到組分峰頂點之間測得的時間，用tR表示。調(diào)整保留時間(AdjustedRetentionTime)：調(diào)整保留時間指組分的保留時間扣除死時間后的時間，用tR’表示。tR’=tR-tM相對保留值（RelativeRetentionValue）相對保留值指某組分i與基準組分s的調(diào)整保留值之比。通常用ris表示。制劑分析技術

提綱§1藥物制劑分析特點

§2片劑分析√

§3注射劑分析√§4復方制劑分析

藥物制劑性狀分析特點藥物制劑鑒別特點藥物劑型檢查特點雜質檢查劑型檢查及安全性檢查藥物制劑含量測定特點§1藥物制劑分析特點藥物制劑類型藥物制劑原料藥物或與適宜輔料制成的供臨床使用的劑型;活性藥物成分的臨床使用形式。藥物制劑類型片劑：口服普通片為主,還有含片、咀嚼片、分散片、泡騰片、緩釋片、腸溶片等；注射劑注射液注射用無菌粉末注射用濃溶液

藥物制劑分析特點

藥物制劑分析比原料藥物分析更困難

藥物制劑組成復雜(含輔料),需樣品預處理排除輔料對分析的干擾；藥物制劑中活性藥物成分含量低,需更靈敏的方法；藥物制劑需劑型檢查；劑型不同,質量控制項與質量指標及排除輔料干擾的方法也不同藥物制劑分析與原料藥分析對比（醋酸氫化可的松為例）藥物制劑分析與原料藥物分析相比性狀:原料藥:感觀、溶解性及理化常數(shù);藥物制劑:感觀;鑒別:原料藥:方法較多;藥物制劑:經(jīng)樣品預處理后選用部分原料藥鑒別試驗;檢查:原料藥:有關物質和干燥失重;藥物制劑:劑型檢查;含量測定:原料藥:無樣品處理；藥物制劑:須樣品預處理。不同制劑類型對比不同的藥物制劑相比給藥方式及給藥部位不同,藥物制劑的質量控制強度不同,口服片劑最弱,注射劑最強；劑型不同，藥物制劑的劑型檢查項目及樣品預處理方法不同一.藥物制劑性狀分析特點藥物制劑質量控制的組成部分；一定程度上綜合表征藥品質量。二.藥物制劑鑒別特點

以原料藥鑒別方法為基礎采用原料藥鑒別實驗:輔料不干擾藥物鑒別；樣品預處理方法排除干擾;

取消該鑒別方法；

改用分離分析方法；輔料干擾藥物鑒別二.藥物制劑鑒別特點例阿司匹林及普通片的鑒別阿司匹林:+FeCl3→紫堇色①;IR③;+Na2CO3+H2SO4(過)→↓白+HAc臭氣②阿司匹林片:+FeCl3→紫堇色;HPLC;片劑鑒別采用原料藥鑒別試驗①，取消鑒別試驗②和③，增加HPLC三.藥物劑型檢查特點例

葡萄糖及其注射液的檢查葡萄糖檢查項：酸度、…、微生物限度；葡萄糖注射液：pH值、5-羥甲基糠醛、重金屬、無菌、細菌內(nèi)毒素、其他（注射劑項下規(guī)定）葡萄糖:雜質檢查，安全性檢查(微生物限度)葡萄糖注射液

雜質檢查

劑型檢查（其他）安全性檢查（無菌、細菌內(nèi)毒素）pH（更精確）5-羥甲基糠醛（生產(chǎn)中產(chǎn)生）重金屬（生產(chǎn)中增加）藥物制劑多與原料藥的含量測定方法不同采用原料藥含量測定方法:輔料不干擾藥物含量測定；過濾、提取、分離法排除干擾再測定或選擇性強法:輔料干擾藥物含量測定濃縮法提高供試液濃度再測定或靈敏度高法:小劑量制劑；超聲等法使藥物完全釋放再測定:緩、控釋制劑；專屬性強分離分析方法:復方制劑。四.藥物制劑含量測定特點四.藥物制劑含量測定特點例

硫酸沙丁胺醇及其制劑的含量測定硫酸沙丁胺醇:非水溶液滴定法；硫酸沙丁胺醇膠囊:HPLC法，內(nèi)容物用流動相振搖使其溶解…硫酸沙丁胺醇緩釋膠囊:HPLC法，內(nèi)容物用0.1mol/L鹽酸超聲使其溶解…制劑與原料藥含量測定方法不同:排除輔料干擾后，用靈敏度高、專屬性強的HPLC;不同劑型含量測定方法相同，但樣品預處理方法不同§2

片劑分析片劑（tablet）:原料藥物或與適宜的輔料混勻壓制而成的圓形或異形的片狀固體制劑?？诜胀ㄆ瑸橹髌瑒┓治鲂誀罘治鲨b別試驗劑型檢查含量測定重量差異與含量均勻度崩解時限與溶出度糖類干擾及其排除硬脂酸鎂干擾及其排除一.性狀制劑通則”片劑下規(guī)定圓形或異形片狀固體制劑外觀完整光潔色澤均勻

符合正文各品種項下的性狀描述二.鑒別試驗過濾、離心、提取方法等排出輔料干擾；參考其原料藥鑒別方法；一組鑒別試驗:2～4種不同原理(化學、光譜、色譜和其他方法)。三.劑型檢查ChP2015四部“制劑通則”片劑項下規(guī)定口服普通片劑型檢查:重量差異和崩解時限;原料藥與輔料難混勻:含量均勻度替代重量差異；片劑中活性藥物成分難溶于水:溶出度替代崩解時限。藥物片劑各片中活性藥物成分的含量因制劑生產(chǎn)中的多種原因而產(chǎn)生差異；需要控制藥物制劑的劑量單位均勻度；重量差異或含量均勻度表示1.【重量差異】(weightvariation)原料藥與輔料混勻，用重量差異檢查藥物片劑的劑量單位均勻度；定義:片重與平均片重之差異平均片重重量差異限度<0.3g/片±7.5%≥0.3g/片±5%（1）規(guī)定糖衣片包衣前檢查；薄膜衣片包衣后檢查1.【重量差異】(weightvariation)（3）判斷:超出限度片≤2片;超出限度1倍片≤1片。()平均片重(標示片重)素片片20每片重量與平均片重比較（2）方法總重PharmaceuticalAnalysis⑴定義:小劑量的制劑每片(個)含量符合標示量的程度2.【含量均勻度】(contentuniformity)

標示量≯25mg或≯25%應檢查含量均勻度；檢查此項的制劑不再檢查重量差異。⑵方法取10片,測定每片以標示量為100的相對含量X。原料藥與輔料難混勻，用含量均勻度代替重量差異PharmaceuticalAnalysis第十八章崩解儀3.【崩解時限】(disintegration)口服固體片劑在胃腸道中的崩解是藥物溶解、被機體吸收及發(fā)揮藥理作用的前提；崩解時限是口服藥物片劑的常規(guī)劑型檢查項；定義:口服固體制劑在規(guī)定條件下，全部崩解溶散或成碎粒所需時間限度。PharmaceuticalAnalysis第十八章對于難溶性藥物的片劑，藥物的溶出與其吸收及產(chǎn)生療效具有更高的相關性；難溶性藥物片劑的溶出度代替崩解時限。4.【溶出度】(dissolution)PharmaceuticalAnalysis第十八章

定義:規(guī)定條件下,活性藥物成分從片劑等制劑中溶出的速度和程度。模擬口服固體制劑在胃腸道里的崩解和溶出情況的體外試驗法；用于難以溶解藥物及緩控釋制劑(釋放度)；檢查該項的藥物無需崩解時限檢查。4.【溶出度】(dissolution)PharmaceuticalAnalysis第十八章方法

6片;500～1000mL溶劑;37±0.5℃;轉速50～200r/min；

規(guī)定的方法,規(guī)定的時間點取樣,0.8μm微孔濾膜過濾,

測定每片溶出量(相當于標示量的%)。PharmaceuticalAnalysis第十八章片劑的輔料：稀釋劑、潤濕劑與黏合劑、崩解劑、潤滑劑等含量測定：需采用樣品預處理方法排除輔料干擾；以糖類稀釋劑和硬脂酸鎂潤滑劑干擾消除為例四.含量測定PharmaceuticalAnalysis第十八章（一）糖類的干擾和消除淀粉，糊精，蔗糖，乳糖等是固體制劑稀釋劑，多糖或雙糖水解后產(chǎn)生葡萄糖及乳糖具有還原性；干擾氧化還原滴定:KMnO4法、KBrO3法等。PharmaceuticalAnalysis第十八章固體制劑潤滑劑:硬脂酸鎂(C17H35COO)2Mg配位常數(shù):被測離子-EDTA>>Mg2+-EDTA，不干擾

pH6.0~7.5,酒石酸(草酸)可掩蔽。（二）硬脂酸鎂的干擾和消除Mg2+干擾EDTA配位滴定；硬脂酸根干擾高氯酸非水滴定。干擾作用消除方法被測藥物含量>>硬脂酸鎂含量，干擾可以忽略；脂溶性有機堿性藥物，堿化萃取分離后，

非水滴定。PharmaceuticalAnalysis第十八章

生物檢定用分析化學基礎66分析化學的定義：

研究獲得物質化學組成，結構信息，分析方法及相關理論的科學。分析化學是化學中的信息科學，以降低系統(tǒng)的不確定度為目的。第一節(jié)分析化學概述67一、分析化學的分類1.按分析任務分類

(1)定性分析

含何種元素，何種官能團

(2)定量分析

含量

(3)結構分析

形態(tài)分析,立體結構,結構與活性68

(1)無機分析

(2)有機分析

(3)生物分析

(4)藥物分析693.按數(shù)量級分類方法試樣質量/mg試樣體積/mL常量分析>100>10半微量分析10~1001~10微量分析0.1~100.01~1超微量分析<0.10.01703.按分析方法分類

化學分析：

1、重量分析

2、容量分析（各種滴定分析）

儀器分析：

1、

電化學分析

2、光化學分析

3、色譜分析

4、波譜分析711酸堿滴定配位滴定氧化還原滴定沉淀滴定電化學分析光化學分析色譜分析波譜分析滴定分析電導、電位、電解、庫侖極譜、伏安發(fā)射、吸收，熒光、光度氣相、液相、離子、超臨界、薄層、毛細管電泳紅外、核磁、質譜化學分析分析化學儀器分析三、分析化學的作用在化學學科發(fā)展中的作用：分子科學、遺傳密碼在化學研究工作中的作用：新物質鑒定結構與性能在現(xiàn)代化學工業(yè)中的作用：質量控制與自動檢測分析化學與社會：環(huán)境、體育、破案7374第三節(jié)定量分析數(shù)據(jù)處理一、誤差的種類、性質、產(chǎn)生的原因及減免1.系統(tǒng)誤差

(1)特點

a.對分析結果的影響比較恒定；

b.在同一條件下，重復測定，重復出現(xiàn)；

c.影響準確度，不影響精密度；

d.可以消除。

產(chǎn)生的原因?

75(2)產(chǎn)生的原因

a.方法誤差——選擇的方法不夠完善例：重量分析中沉淀的溶解損失；滴定分析中指示劑選擇不當

b.儀器誤差——儀器本身的缺陷例：天平兩臂不等，砝碼未校正；滴定管，容量瓶未校正。

c.試劑誤差——所用試劑有雜質例：蒸餾水不合格；試劑純度不夠(含待測組份或干擾離子)。

d.主觀誤差——操作人員主觀因素造成例：對指示劑顏色辨別偏深或偏淺；滴定管讀數(shù)不準。76

2.偶然誤差

(

1)特點

a.不恒定

b.難以校正

c.服從正態(tài)分布(統(tǒng)計規(guī)律)

(

2)產(chǎn)生的原因

a.偶然因素

b.滴定管讀數(shù)

3.過失誤差77二、誤差的減免

1.系統(tǒng)誤差的減免

(1)方法誤差——

采用標準方法,對比實驗

(2)儀器誤差——

校正儀器

(3)試劑誤差——

作空白實驗

2.偶然誤差的減免

——增加平行測定的次數(shù)78二、準確度和精密度1.準確度和精密度——分析結果的衡量指標。

(1)準確度──分析結果與真實值的接近程度

準確度的高低用誤差的大小來衡量；

誤差一般用絕對誤差和相對誤差來表示。絕對誤差=測定值–真實值絕對誤差相對誤差=×100

真實值79(2)精密度──幾次平衡測定結果相互接近程度

精密度的高低用偏差來衡量，偏差是指個別測定值與平均值之間的差值。

80（一）平均偏差

平均偏差又稱算術平均偏差，用來表示一組數(shù)據(jù)的精密度。

平均偏差：

平均偏差相對平均偏差

=×100

平均值

特點：簡單；

缺點：大偏差得不到應有反映。81（二）標準偏差

相對標準偏差：（變異系數(shù)）=S/X

標準偏差又稱均方根偏差；有限測定次數(shù)標準偏差：

82

相對偏差與絕對偏差

a基準物：硼砂Na2B4O7·10H2OM=381

碳酸鈉Na2CO3

M=106

選那一個更能使測定結果準確度高？（不考慮其他原因，只考慮稱量）

b：如何確定滴定體積消耗？

0～10ml；20～25ml；40～50ml83例題用標準偏差比用平均偏差更科學更準確。

例:兩組數(shù)據(jù)

(1)X-X：0.11,-0.73,0.24,0.51,-0.14,0.00,0.30,-0.21,

n=8d1=0.28s1=0.38(2)

X-X：0.18，0.26，-0.25，-0.37，0.32，-0.28，0.31，-0.27

n=8d2=0.28s2=0.29

d1=d2,

s1>s284例：水垢中Fe2O3的百分含量測定數(shù)據(jù)為(測6次)：

79.58%，79.45%，79.47%，

79.50%，79.62%，79.38%

X=79.50%s=0.09%sＸ=0.04%

則真值所處的范圍為（無系統(tǒng)誤差）：

79.50%+0.04%

數(shù)據(jù)的可信程度多大？如何確定？例題85

2、準確度和精密度的關系

精密度是保證準確度的先決條件；精密度高不一定準確度高；兩者的差別主要是由于系統(tǒng)誤差的存在。

86三、可疑數(shù)據(jù)的取舍

可疑數(shù)據(jù)的取舍

過失誤差的判斷，確定某個數(shù)據(jù)是否可用。方法：4d法、Q檢驗法1．4d法步驟：

（1）求出可疑值外數(shù)據(jù)的平均值x及平均偏差d

（2）可疑數(shù)值與平均值之差的絕對值與4d相比

|可疑數(shù)值－平均值|≥4d時，舍去。

872．Q檢驗法步驟：

（1）數(shù)據(jù)排列X1

X2……Xn

（2）求極差Xn

－X1

（3）求可疑數(shù)據(jù)與相鄰數(shù)據(jù)之差

Xn

－Xn-1或X2－X1

（4）計算：88

（5）根據(jù)測定次數(shù)和要求的置信度，（如90%）查表：

表1--2不同置信度下，舍棄可疑數(shù)據(jù)的Q值表

測定次數(shù)Q90

Q95

Q99

3

0.940.980.994

0.760.850.93

8

0.470.540.63

（6）將Q與QX

（如Q90

）相比，若Q>QX

舍棄該數(shù)據(jù),（過失誤差造成）若Q<QX

舍棄該數(shù)據(jù),（偶然誤差所致）當數(shù)據(jù)較少時舍去一個后，應補加一個數(shù)據(jù)。89四、有效數(shù)字1．實驗過程中常遇到的兩類數(shù)字

（1）數(shù)目：如測定次數(shù)；倍數(shù)；系數(shù)；分數(shù)（2）測量值或計算值。數(shù)據(jù)的位數(shù)與測定準確度有關。記錄的數(shù)字不僅表示數(shù)量的大小，而且要正確地反映測量的精確程度。結果絕對偏差相對偏差有效數(shù)字位數(shù)

0.51800±0.00001