花青素還原酶（ANR）活性檢測試劑盒實驗解決方案

花青素還原酶（ANR）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理花青素還原酶（Anthocyanidinreductase,ANR）是原花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，可使花色素轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的順式黃烷-3-醇，對植物體內(nèi)類黃酮類物質(zhì)的合成、花色苷的積累，具有重要作用。CheKine?花青素還原酶（ANR）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內(nèi)ANR活性，其原理是：ANR可催化NADPH和花色素轉(zhuǎn)化為黃烷-3-醇和NADP+，NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+沒有；通過測定340nm光吸收下降速率，計算ANR活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·制冰機(jī)、低溫離心機(jī)、水浴鍋·去離子水、無水乙醇·勻漿器試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；內(nèi)含不溶物，使用前搖勻；4℃保存。ReagentⅠ：即用型；4℃保存。ReagentⅡ：粉劑，臨用前，96T加入1.4mL去離子水，48T加入0.7mL去離子水，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存一周，禁止反復(fù)凍融。ReagentⅢ：粉劑，臨用前96T加入1mL50%乙醇，48T加入0.5mL50%乙醇，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存一周，禁止反復(fù)凍融。ReagentⅣ：粉劑，臨用前96T加入1mL去離子水，48T加入0.5mL去離子水，充分混勻待用；4℃保存一周。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，樣本如果不是立即測定，可在-80℃保存一個月。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer（注意混勻），進(jìn)行冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟1.酶標(biāo)儀或紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm。紫外分光光度計用去離子水調(diào)零。2.恒溫箱預(yù)熱到37℃。3.加樣：試劑測定孔（μL）對照孔（μL）ReagentⅠ170170ReagentⅡ1010ReagentⅢ55Sample100充分混勻后，37℃反應(yīng)30minReagentⅣ55Sample0104.混勻后，測量測定孔和對照孔在340nm下的吸光度，分別記為A測定、A對照，計算ΔA=A對照-A測定。注意：實驗之前，建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果ΔA小于0.001，可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.4，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋（計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)），或減少提取用樣本量。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。A.使用96孔UV板測定的計算公式1.按照蛋白濃度計算活性單位定義：每mg蛋白每分鐘減少1nmolNADPH為1個酶活單位。ANR酶活(U/mgprot)=(ΔA÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T×n=214.36×ΔA÷Cpr×n2.按照樣本質(zhì)量計算活性單位定義：每g組織每分鐘減少1nmolNADPH為1個酶活單位。ANR酶活(U/g鮮重)=(ΔA÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T×n=214.36×ΔA÷W×nε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，L，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.01mL；T：反應(yīng)時間，30min；n：樣本稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量，g；V樣總：Extraction

Buffer的體積，1mL。B.使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中的光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計算即可。結(jié)果展示ANR(ANR(U/g)Figure1.玉米葉、芒果和葡萄中的ANR活性。相關(guān)產(chǎn)品C