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體外診斷產(chǎn)品的生產(chǎn)監(jiān)管北京市醫(yī)療器械檢查所
重要內(nèi)容體外診斷產(chǎn)品的種類體外診斷產(chǎn)品生產(chǎn)的基本原理生化類產(chǎn)品免疫類產(chǎn)品分子類和血液類溯源性問題
體外診斷作用“醫(yī)生的眼睛”預(yù)測和診斷功能,如:血細胞抗體(肝炎、艾滋、IGE)基因(唐氏、小兒耳聾、遺傳缺陷基因BRCA1)。療效和健康監(jiān)測,如:代謝物(血糖)標(biāo)志物(AFP、PSA、HPV)蛋白、微量元素(白蛋白、Ca);
體外診斷產(chǎn)品的類別體外診斷根據(jù)風(fēng)險分3類:III類:致病性病原體抗原、抗體以及核酸、人類基因檢測、腫瘤標(biāo)志物、血型、組織配型、變態(tài)反應(yīng)(過敏原)等;II類:除III、I類,如:蛋白質(zhì)、糖類、酯類、酶類、維生素、無機離子、激素等;I類:微生物培養(yǎng)基(不用于微生物鑒別和藥敏試驗)、樣本處理用產(chǎn)品,如溶血劑、稀釋液、染色液等。
體外診斷產(chǎn)品的類別體外診斷專業(yè)分類:生化、免疫、分子生物學(xué)、微生物、體液等,臨床使用超過千種。生化:生物化學(xué)反應(yīng)或免疫反應(yīng)(生化儀的項目),酶類、糖類、脂類、蛋白、無機元素、肝功能、腎功等指標(biāo)。免疫:抗原與抗體相結(jié)合的特異性反應(yīng),傳染性疾病、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢測、血型鑒定等。分子診斷:分子生物學(xué)措施檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的構(gòu)造或體現(xiàn)水平的變化,重要用于肝炎、性病、優(yōu)生優(yōu)育、遺傳病基因、腫瘤等檢測。
體外診斷產(chǎn)品的類別微生物:通過培養(yǎng)鑒別細菌等微生物的措施。血液學(xué):通過電阻抗、激光和高能電磁波等技術(shù)檢測血液中血細胞的數(shù)量和分類的措施。
生化類產(chǎn)品基本措施生化分析儀反應(yīng)的一般稱為生化試劑兩點法、終點法、速率法、比濁法兩點法:測定酶反應(yīng)開始后某一時間內(nèi)(t1到t2)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量以求取酶反應(yīng)初速度的措施。終點法:通過測定酶反應(yīng)開始到反應(yīng)到達平衡時產(chǎn)物或底物濃度總變化量,以求出酶活力的措施,亦稱平衡法。
速率法:是指持續(xù)測定(每15秒~1分鐘監(jiān)測一次)酶反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時間的變化來求出酶反應(yīng)的初速度的措施,即持續(xù)監(jiān)測法。透射比濁法透射比濁法可用于測定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項目。
生化類產(chǎn)品基本措施
終點法常用的有總膽紅素(氧化法或重氮法)、結(jié)合膽紅素(氧化法或重氮法)、血清總蛋白(雙縮脲法)、血清白蛋白(溴甲酚氯法)、總膽汁酸(酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)、總膽固醇(膽固醇氧化酶法)、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(直接測定法)、鈣(偶氮砷Ⅲ法)、磷(紫外法)、鎂(二甲苯胺藍法)。兩點法:
苦味酸法測定肌酐采用此法速率法對于酶活性測定,如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ谷氨氨?;D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。某些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯(lián)法測定尿素等,也可用持續(xù)監(jiān)測法。(7個酶加葡萄糖、尿素)免疫比濁法載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗“O”、類風(fēng)濕因子,以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。(蛋白)
生化類產(chǎn)品闡明書
生化分析儀闡明書除法規(guī)有關(guān)規(guī)定外,還至少包括:合用機型反應(yīng)溫度(37度)主波長、次波長
孵育時間(終點法或兩點法)延遲時間(持續(xù)監(jiān)測法)、持續(xù)監(jiān)測時間在延遲時間之后即開始,一般為60~120s不少于4個吸光度檢測點(3個吸光度變化值);加樣量校準(zhǔn)液個數(shù)(非線性必須兩個以上)等。
原則液個數(shù)的原因校準(zhǔn)液個數(shù)濃度校準(zhǔn)曲線線性好并通過坐標(biāo)零點的,可采用一種校準(zhǔn)液;線性好但不通過坐標(biāo)零點,應(yīng)使用兩個校準(zhǔn)液;對于校準(zhǔn)曲線呈非線性者,必須使用兩個以上校準(zhǔn)液。每一種校準(zhǔn)液都要有一種合適的濃度。吸光度濃度105600030008生化類產(chǎn)品基本原理氧化反應(yīng):還原反應(yīng):
生化類產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險點分析原材料(輔酶I)(進貨檢查記錄或生產(chǎn)記錄中,應(yīng)包括輔酶空白吸光度的檢查記錄,且不一樣的類別符合下述特點)還原性輔酶I重要用于下降反應(yīng),當(dāng)還原性輔酶I質(zhì)量出現(xiàn)問題時,試劑的空白吸光度減少,導(dǎo)致試劑測量成果的不確定度變大,測量的敏捷度也隨之減少,測量線性范圍變小。氧化性輔酶I重要用于上升反應(yīng),當(dāng)氧化性輔酶I質(zhì)量出現(xiàn)問題時,試劑的空白吸光度升高,導(dǎo)致試劑測量成果的不確定度變大,測量的敏捷度也隨之減少,測量線性范圍變小。
生化類產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險點分析生產(chǎn)記錄中應(yīng)包括試劑用水的電導(dǎo)率、PH值及微生物檢查記錄生化類產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險點分析
免疫類產(chǎn)品基本原理Elisa反應(yīng)的基本原理(酶標(biāo)儀、發(fā)光儀等)將具有已知抗體的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里,洗滌一次;②加待測抗原,如兩者是特異的,則發(fā)生結(jié)合,然后把多出抗體洗除;③加入與待測抗原呈特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體(二抗),使形成“夾心”;④加入該酶的底物,若看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生,闡明在孔壁上存在對應(yīng)的抗原。
免疫類產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險點分析辣根過氧化物酶過氧化物酶(HRP)廣泛分布于植物中,辣根中含量最高,從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶(HRP),酶蛋白和輔基的最大吸取光譜分別為275nm和403nm。酶的純度以RZ表達:RZ=OD403/OD275純酶的RZ多在3.0以上,最高為3.4。RZ在0.6如下的酶制品為粗酶,非酶蛋白約占75%,不能用于標(biāo)識。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)識。(檢查進貨檢查記錄或生產(chǎn)過程記錄)
免疫產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險點分析酶與抗體的活性常用瓊脂擴散或免疫電泳法,使抗原與抗體形成沉淀線,經(jīng)PBS漂洗1天,再以蒸餾水浸泡1小時,將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色,假如出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng),再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪,表達結(jié)合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后,瓊擴滴度應(yīng)在1:16以上。另一種測定措施是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA措施進行方陣滴定,此法不僅可以測定標(biāo)識效果,還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。
免疫類產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險點分析在產(chǎn)品進貨檢查記錄或生產(chǎn)記錄中檢查如下內(nèi)容:1、酶標(biāo)識二抗的活性;2、用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時效果一般,為500(g/ml時效果很好,達1000(g/ml時效果最佳;3、酶結(jié)合率為7%時效果一般,為9%-10%很好,達30%以上最佳;4、一抗進貨檢查記錄,單抗還是多抗,也可小樣測試活性;5、一抗包被的工藝記錄與質(zhì)量體系文獻中規(guī)定與否一致;5、儲存環(huán)境同生化產(chǎn)品;
分子類產(chǎn)品基本原理PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是運用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(常常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合,再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一種溫控設(shè)備,能在變性溫度,復(fù)性溫度,延伸溫度之間很好地進行控制。
分子類產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險點
1、引物質(zhì)量,多為購置,可做小樣,采購記錄中查小樣測試記錄;2、聚合酶質(zhì)量,多為購置,可測定,可做小樣,采購記錄中查小樣測試記錄;3、內(nèi)標(biāo):已知帶有引物片段樣本,與被測樣本同步擴增,應(yīng)顯示陽性,檢查測試記錄;4、PCR生產(chǎn)企業(yè)控溫精度(95度、55度和75度)和變化率的記錄。5、實地檢查PCR試劑的質(zhì)控(內(nèi)標(biāo))和生產(chǎn)與否在各自獨立的建筑中進行。并且試驗室分為試劑配制區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。并且考慮房間的正負壓保護樣本不被污染、人員不被感染。95度(高溫)55度低溫75度(反應(yīng)溫度)95度
血液類產(chǎn)品基本原理懸浮在電解液中的顆粒/細胞,隨電解液通過小孔管時,因取代了相似體積的電解液,在恒電流設(shè)計的電路中導(dǎo)致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化,而產(chǎn)生了電位脈沖。脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。
血液類產(chǎn)品質(zhì)量控制點1、生產(chǎn)記錄中檢查溶血劑、稀釋液的顆粒物、微生物檢查記錄;2、血細胞分析儀稀釋液生產(chǎn)車間需控制潔凈度和菌落數(shù);3、檢查室的血液分析儀與否采用定值血定期校準(zhǔn);4、檢查室的血液分析儀內(nèi)部質(zhì)控成果,紅白偏差與否符合規(guī)定(尤其是血小板)。
體外診斷試劑溯源校準(zhǔn)液個數(shù)濃度校準(zhǔn)曲線線性好并通過坐標(biāo)零點的,可采用一種校準(zhǔn)液;線性好但不通過坐標(biāo)零點,應(yīng)使用兩個校準(zhǔn)液;對于校準(zhǔn)曲線呈非線性者,必須使用兩個以上校準(zhǔn)液。每一種校準(zhǔn)液都要有一種合適的濃度。吸光度濃度105600030008國家食品藥物監(jiān)督管理局
體外診斷試劑監(jiān)督抽驗—61個國產(chǎn)TG試劑新鮮混合血清最大正偏倚為22.1%,最大負偏倚為-18.9%,39%bias<±5%
體外診斷試劑溯源校準(zhǔn)品與質(zhì)控品區(qū)別校準(zhǔn)品目的是為了產(chǎn)品的精確性,溯源性是必須的;質(zhì)控品目的是為了產(chǎn)品的精密度,穩(wěn)定性是必須的,可不具有溯源性。溯源性有多重要?臨床檢查:對搜集的患者標(biāo)本只做一次檢查,就發(fā)出匯報精確性局限性是重要的臨床檢查質(zhì)量問題影響檢查成果“臨床精確性”的原因是多方面的-樣品采集與處理,病人準(zhǔn)備,(生物變異),人為錯誤-措施:對的度(校準(zhǔn))、精密度、特異性、線性、檢測限等溯源理論上處理的是對的度問題(校準(zhǔn)問題)
體外診斷試劑溯源
體外診斷試劑溯源原則物質(zhì)制造商選定措施主校準(zhǔn)品制造商常設(shè)措施產(chǎn)品校準(zhǔn)品常規(guī)措施血樣
體外診斷試劑溯源1、有溯源性才能判斷精確性;2、檢查成果才能互認;目前問題1、CRM缺乏;2、反應(yīng)原理差異,導(dǎo)致成果有差異,但Cutoff值也不一樣,不影響臨床判斷,成果無法互認;3、各自溯源途徑不一樣,成果存在差異。
體外診斷試劑溯源目前采用的精確性評價措施1.國標(biāo)物質(zhì)、國際原則物質(zhì)(有溯源性)(查驗原則物質(zhì)證明材料,一般為證書)2.回收試驗(有一定溯源性)(添加物質(zhì)純度,試驗記錄)3
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