DB50T 1006-2020 牛肺炎支原體抗體檢測(cè)方法　

ICS11.220B43DB50Enzyme-linkerimmunosorbentassayForMycoplasma2020-05-20發(fā)布重慶市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB50/T1006—2020本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009進(jìn)行起草。本標(biāo)準(zhǔn)由重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草人:藺露、曾政、姚璐、董春霞、孫燕、謝建華、陳忠瓊、凌洪權(quán)、梁望旺、楊澤林、程千川。DB50/T1006—2020牛肺炎支原體抗體檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛肺炎支原體抗體檢測(cè)方法，利用牛肺炎支原體抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，檢測(cè)牛肺炎支原體抗體。本方法適用于檢測(cè)牛血清（血漿）的牛肺炎支原體抗體。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。牛肺炎支原體是指引起牛傳染性支原體肺炎（又稱(chēng)爛肺?。┮苑尾坎∽?yōu)橹饕卣鞯膫魅静〉囊环N支原體。3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)簡(jiǎn)稱(chēng)酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法。將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)。4牛肺炎支原體P39抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)4.1試驗(yàn)材料洗液：配制見(jiàn)附錄第A.1章；稀釋液：配制見(jiàn)附錄第A.2章；標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：含牛肺炎支原體抗體的牛血清；標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無(wú)牛肺炎支原體抗體的牛血清；酶結(jié)合物：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗牛IgG；底物溶液：配制參見(jiàn)附錄第A.3-A.4章；終止液：配制參見(jiàn)附錄第A.5章。4.2操作步驟4.2.1樣品準(zhǔn)備將被檢血清（或血漿）用稀釋液（見(jiàn)附錄A.2）做1:40稀釋。4.2.2加樣取出抗原包被板，A1、B1加入100μL陰性對(duì)照，C1、D1加入100μL陽(yáng)性對(duì)照，其余孔加入1:40稀釋的被檢血清（血漿），每孔100μL，將加樣位置做好記錄，用封膜封板，室溫孵育30min。4.2.3洗滌1DB50/T1006—2020吸除孔內(nèi)液體，每孔加300μL沖洗液（見(jiàn)附錄A.1）沖洗，重復(fù)5次，在吸水紙上輕拍，確?？變?nèi)無(wú)殘留液體。4.2.4加酶標(biāo)抗體每孔加入酶標(biāo)抗體液100μL，以封膜封板，室溫孵育30min。4.2.5洗滌洗滌方法同4.2.3。4.2.6加底物每孔加入100μL底物使用液（見(jiàn)附錄A.3和附錄A.4），室溫孵育10min。4.2.7終止加終止液（見(jiàn)附錄A.5），100μL/孔，使其終止反應(yīng)。4.3結(jié)果判定設(shè)定酶標(biāo)儀檢定波長(zhǎng)在450nm（即OD值）；陽(yáng)性對(duì)照均值（PC）＞0.5，陽(yáng)性對(duì)照OD值的均值（PC）與陰性對(duì)照均值（NC）的比值＞4，判定實(shí)驗(yàn)有效，若兩者不成立，則實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重復(fù)；待測(cè)樣本的判定，S/P值≥0.4者判定為陽(yáng)性，S/P值＜0.4為陰性樣本。S/P=其中S為待測(cè)樣本的OD值。2DB50/T1006—2020TMB(2mg/mL)底物緩沖液（pH5.5）9.5mL0.75%H2O2