《蛋白表達純化》課件

蛋白表達純化歡迎參加蛋白表達純化課程。本課程將深入探討蛋白質(zhì)表達和純化的關(guān)鍵技術(shù)，為您的研究工作提供實用指導。課程目標全面理解掌握蛋白質(zhì)表達和純化的基本原理與方法。實踐技能學習各種表達系統(tǒng)和純化技術(shù)的操作步驟。問題解決培養(yǎng)優(yōu)化蛋白質(zhì)產(chǎn)量和純度的能力。應用拓展了解蛋白質(zhì)研究的最新進展和應用前景。蛋白質(zhì)概述結(jié)構(gòu)單元蛋白質(zhì)是生命的基本構(gòu)建模塊，由氨基酸鏈組成。功能多樣蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)執(zhí)行各種關(guān)鍵功能，如催化、信號傳導等?；虍a(chǎn)物蛋白質(zhì)是基因表達的最終產(chǎn)物，反映遺傳信息。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1四級結(jié)構(gòu)多個亞基的組合2三級結(jié)構(gòu)多肽鏈的三維折疊3二級結(jié)構(gòu)α螺旋和β折疊4一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列蛋白質(zhì)功能酶催化加速生化反應，如消化酶分解食物。信號傳導激素和受體蛋白參與細胞間通訊。結(jié)構(gòu)支持如肌動蛋白和肌球蛋白構(gòu)成肌肉纖維。免疫防御抗體蛋白識別和中和外來病原體。蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)原核表達大腸桿菌表達系統(tǒng)，適合簡單蛋白質(zhì)。真核表達酵母、昆蟲和哺乳動物細胞系統(tǒng)，適合復雜蛋白質(zhì)。無細胞表達體外快速表達系統(tǒng)，適合特殊蛋白質(zhì)。大腸桿菌表達系統(tǒng)1優(yōu)勢生長快速，表達量高，成本低。2局限性不適合表達復雜糖蛋白或膜蛋白。3應用廣泛用于簡單蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)。酵母表達系統(tǒng)選擇菌株選擇合適的酵母菌株，如釀酒酵母。構(gòu)建載體設(shè)計并構(gòu)建表達載體，插入目標基因。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)將載體轉(zhuǎn)化入酵母細胞，篩選陽性克隆。誘導表達添加誘導劑，促進目標蛋白表達。昆蟲細胞表達系統(tǒng)1構(gòu)建桿狀病毒將目標基因插入桿狀病毒基因組。2感染昆蟲細胞用重組病毒感染昆蟲細胞，如Sf9細胞。3蛋白質(zhì)表達感染細胞大量表達目標蛋白質(zhì)。4收集純化收集培養(yǎng)上清或裂解細胞，純化目標蛋白。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)基因構(gòu)建設(shè)計哺乳動物表達載體，插入目標基因。細胞培養(yǎng)培養(yǎng)HEK293或CHO等哺乳動物細胞系。轉(zhuǎn)染表達使用脂質(zhì)體或病毒介導轉(zhuǎn)染，誘導表達。蛋白質(zhì)表達策略1優(yōu)化表達條件調(diào)整溫度、pH和誘導時間。2融合標簽設(shè)計添加His標簽或GST標簽輔助純化。3密碼子優(yōu)化根據(jù)宿主偏好性優(yōu)化基因序列。4表達系統(tǒng)選擇根據(jù)蛋白特性選擇合適表達系統(tǒng)。突變體構(gòu)建定點突變改變特定氨基酸，研究其功能。使用PCR或基因合成技術(shù)實現(xiàn)。截短突變刪除蛋白質(zhì)的某些區(qū)域，研究結(jié)構(gòu)域功能。常用于提高可溶性。插入突變在蛋白質(zhì)中插入新的氨基酸序列，如標簽或功能域。轉(zhuǎn)化與篩選1制備感受態(tài)細胞處理宿主細胞，使其能夠吸收外源DNA。2轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導入感受態(tài)細胞。3平板篩選在含抗生素的培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。4鑒定驗證通過PCR或測序確認目標基因的存在。誘導表達IPTG誘導用于lac操縱子控制的表達系統(tǒng)，如pET系統(tǒng)。甲醇誘導常用于畢赤酵母表達系統(tǒng)。四環(huán)素誘導用于Tet操縱子控制的表達系統(tǒng)。熱激誘導利用熱激啟動子控制表達。細胞裂解超聲破碎利用超聲波破壞細胞膜，適用于小規(guī)模樣品。高壓均質(zhì)通過高壓使細胞破裂，適合大規(guī)模制備。凍融法反復凍融使細胞破裂，溫和但效率較低。蛋白質(zhì)分離離心分離去除細胞碎片和不溶性物質(zhì)。沉淀分離利用鹽析或有機溶劑沉淀目標蛋白。膜過濾使用不同孔徑的膜分離不同大小的蛋白。層析分離根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)進行精細分離。層析技術(shù)親和層析原理利用蛋白質(zhì)與特定配體的特異性結(jié)合進行分離。常用標簽His標簽、GST標簽、FLAG標簽等。洗脫方法競爭性洗脫或pH變化洗脫。離子交換層析陽離子交換分離帶正電荷的蛋白質(zhì)。陰離子交換分離帶負電荷的蛋白質(zhì)。pH影響通過調(diào)節(jié)pH改變蛋白質(zhì)電荷。鹽梯度洗脫使用遞增的鹽濃度梯度洗脫蛋白質(zhì)。凝膠過濾層析1原理根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進行分離。2優(yōu)勢可用于蛋白質(zhì)脫鹽和分子量測定。3局限性分辨率較低，不適合分離相近大小的蛋白。4應用常用于蛋白質(zhì)純化的最后一步。反相層析原理基于蛋白質(zhì)疏水性差異進行分離。固定相通常使用C18或C8修飾的硅膠。洗脫使用有機溶劑濃度梯度洗脫。純化過程優(yōu)化1條件篩選優(yōu)化緩沖液、pH和鹽濃度。2多步策略組合不同純化方法提高純度。3添加劑使用使用還原劑或穩(wěn)定劑提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。4流程自動化利用FPLC系統(tǒng)提高效率和重復性。純度分析電泳分析SDS評估蛋白質(zhì)純度和分子量。色譜分析HPLC或SEC評估純度和聚集狀態(tài)。質(zhì)譜分析精確測定蛋白質(zhì)分子量和修飾。SDS樣品制備蛋白質(zhì)與SDS變性，加熱處理。電泳分離在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。染色顯色使用考馬斯亮藍或銀染色顯示蛋白質(zhì)條帶。結(jié)果分析根據(jù)條帶數(shù)量和強度評估純度。Westernblot1電泳分離SDS分離蛋白質(zhì)。2轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF或硝酸纖維素膜上。3抗體雜交使用特異性抗體檢測目標蛋白。4顯影檢測使用化學發(fā)光或熒光方法檢測信號。ELISA直接ELISA抗原直接吸附于板上，用標記抗體檢測。間接ELISA使用未標記一抗和標記二抗檢測。夾心ELISA用捕獲抗體和檢測抗體夾心檢測抗原。競爭ELISA樣品抗原與標記抗原競爭結(jié)合抗體?；钚詼y定酶活性測定測量底物轉(zhuǎn)化率或產(chǎn)物生成速率。結(jié)合活性測定評估蛋白質(zhì)與配體的親和力。細胞功能測定觀察蛋白質(zhì)對細胞行為的影響。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征X射線晶體學高分辨率解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。需要獲得高質(zhì)量晶體。核磁共振(NMR)在溶液狀態(tài)下研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學。適用于小型蛋白。冷凍電鏡觀察大型蛋白復合物的結(jié)構(gòu)。近年來分辨率顯著提高。結(jié)構(gòu)預測序列同源性建?；谝阎吹鞍捉Y(jié)構(gòu)預測目標蛋白結(jié)構(gòu)。從頭預測僅依據(jù)氨基酸序列預測三維結(jié)構(gòu)。人工智能方法如AlphaFold2，利用深度學習預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。分子動力學模擬模擬蛋白質(zhì)在溶液中的動態(tài)行為。結(jié)構(gòu)確定1功能解析基于結(jié)構(gòu)推測蛋白質(zhì)功能2結(jié)構(gòu)精修優(yōu)化初始模型3數(shù)據(jù)收集X射線衍射或NMR譜圖4樣品制備蛋白質(zhì)結(jié)晶或同位素標記應用案例分享胰島素生產(chǎn)重組DNA技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素，治療糖尿病。單克隆抗體利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)治療性抗體。CRISPR/