高級分子生物學

PAGEPAGE1抗體芯片技術(shù)的應(yīng)用黃雪梅060907030高級分子生物學摘要：抗體芯片,是蛋白質(zhì)芯片的一種,是檢測生物樣品中蛋白表達模式的新方法。這種新技術(shù)可以在一次實驗中比較生物樣品中成百上千的蛋白質(zhì)的相對豐度,將極大促進蛋白質(zhì)組目前的研究狀況。抗體芯片可以分析樣品之間的差異;確定相應(yīng)蛋白質(zhì)的性質(zhì);分析細胞提取物或者血清蛋白質(zhì)混合物;還可以進行生物化學平行分析;檢測蛋白表達水平變化?？贵w芯片雖然發(fā)展的時間比較短,但是進展迅速,在多個領(lǐng)域中得到了較好的運用。關(guān)鍵詞：抗體芯片、應(yīng)用、檢測前言：自從DNA芯片被研制出來之后，DNA芯片技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于對生物樣品中的各種已知或未知的核酸序列表達的檢測和比較研究。但隨著人類基因組的工作圖譜的順利完成和后基因組時代的到來，人們發(fā)現(xiàn)僅從基因組序列的角度無法完整、系統(tǒng)地闡明生物體的功能，因此，科學工作者的重心開始轉(zhuǎn)向基因的表達產(chǎn)物———蛋白質(zhì)的研究上來，蛋白質(zhì)組學成為人們的研究重點。本文主要對抗體芯片技術(shù)的應(yīng)用作了一個簡單的綜述。l.抗體芯片產(chǎn)生的背景蛋白質(zhì)組學是指一種生物、一個基因組或一種細胞、組織在特定時空上所擁有的全套蛋白質(zhì)。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)通常都要經(jīng)過基因轉(zhuǎn)錄后的加工和翻譯后的加工。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后選擇性剪接、RNA編輯以及蛋白質(zhì)翻譯后的剪接、修飾等，使得蛋白質(zhì)的數(shù)量大大增加。蛋白質(zhì)芯片,又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。蛋白質(zhì)芯片可以分為蛋白質(zhì)功能芯片和蛋白質(zhì)檢測芯片。蛋白質(zhì)功能芯片是在一特定模板上固定成千上萬個蛋白質(zhì)分子,用于蛋白質(zhì)功能的研究;而蛋白質(zhì)檢測芯片則含有蛋白質(zhì)檢測試劑,用于蛋白質(zhì)的定性、定量測定?？贵w芯片技術(shù)作為蛋白質(zhì)芯片的一種在此基礎(chǔ)上也在不斷的發(fā)展?？贵w芯片是蛋白質(zhì)芯片的一種，是依賴于抗體作為親合體固定在固相載體的表面,通過特異性的免疫反應(yīng)捕獲待測樣品中的抗原，從而實現(xiàn)高通量的免疫檢測，可以一次性的檢測上百上千種蛋白質(zhì)的表達豐度?？贵w芯片具有特異性強，敏感性高，檢測范圍廣等優(yōu)勢，已經(jīng)應(yīng)用在醫(yī)學、生物學、藥學等多個領(lǐng)域，是蛋白質(zhì)芯片研究中進展速度較快的一個分支[1]。2.抗體芯片的分類①平板芯片：早期的蛋白芯片大都將蛋白質(zhì)直接點樣在硝酸纖維素膜或者玻片上,芯片密度低。②微孔芯片：它能夠檢測攜帶報告基因或者熒光指示劑的單個細胞。微孔芯片能夠?qū)⒎磻?yīng)局限化,不僅減少樣品的用量,而且可以減少鄰近微孔之間液滴的相互流動。③微流路芯片：微流路芯片由通過管道連接微孔組成,允許在微型化的形式下處理液體,通過蛋白激酶A的變化來監(jiān)測蛋白質(zhì)的磷酸化水平。④其他芯片：SELDI芯片,表面質(zhì)子共振(SPR)芯片,以及以磁珠為基礎(chǔ)的芯片。3.抗體芯片的穩(wěn)定性及優(yōu)缺點保護抗體不變性是抗體芯片一個重要參數(shù),在點樣或者后來與靶蛋白孵育的過程中的水分蒸發(fā)可以導致抗體變性?？贵w芯片的另外一個重要參數(shù)是保持芯片的長期穩(wěn)定性,尤其是保持高密度抗體芯片的功能穩(wěn)定性。二糖可以明顯提高抗體的穩(wěn)定性。根據(jù)框架H3223/VL1247設(shè)計的重組抗體顯示出高穩(wěn)定性,這種抗體芯片可以在干燥的情況下保持6個月以上?？贵w芯片的優(yōu)點是能高通量、特異性、高靈敏的鑒定抗體與靶蛋白之間的反應(yīng),需要的樣品體積小,在樣品有限的情況下尤其重要,為了進一步減少所需要的樣品量,可以使用微流系統(tǒng)制造高密度的芯片,這個方法既可以將抗體局限,又可以將少量樣品傳送到指定的位置。盡管抗體芯片有很多優(yōu)點,但是也存在很大的局限性:難以獲得大量多樣性的抗體分子;蛋白質(zhì)標記是抗體芯片的瓶頸?？贵w芯片上的抗體結(jié)合的表面積大,與樣品蛋白結(jié)合時會出現(xiàn)交叉反應(yīng),因此,盡管抗體可以識別特異的表位,但不能保證一定與目的蛋白結(jié)合[2]。4.抗體芯片的應(yīng)用4.1抗體芯片在檢測尿液中嗎啡含量的應(yīng)用抗體芯片競爭抑制法檢測尿液中的嗎啡含量具有靈敏度高,特異性好、操作簡單、高通量等優(yōu)點,可用于法醫(yī)毒物檢測、戒毒效果監(jiān)測。運用抗體芯片檢測尿液中的嗎啡及其代謝物含量需要的樣品僅4μl,試驗基于抗原抗體反應(yīng)原理,其特異性高,且操作簡單、耗時少。嗎啡是小分子有機化合物,其本身不具備免疫原性,必須共價地結(jié)合在大分子的蛋白上才能進行基于免疫反應(yīng)原理的檢測,經(jīng)過修飾的嗎啡分子碳環(huán)上C3、C6與BSA結(jié)合,形成嗎啡2BSA復(fù)合物可以作為免疫原免疫動物產(chǎn)生成抗體。競爭抑制試驗是將嗎啡抗體固定在瓊脂糖膜包被的玻片上制備成抗體芯片,采用熒光標記BSA2嗎啡復(fù)合物與待測樣本進行競爭抑制反應(yīng)。由于固相抗體結(jié)合位點有限,待測樣品中嗎啡越多,結(jié)合的抗體位點就越多,而留給Cy32嗎啡2BSA與抗體結(jié)的位點越少,檢測到的熒光信號弱,而反之則熒光信號強,用共聚焦芯片掃描儀采集反應(yīng)圖象并進行圖像分析,并以此間接推斷出待檢樣品中嗎啡的含量?？贵w芯片廣泛用于研究細胞功能和蛋白質(zhì)之間相互作用,具有高通量的優(yōu)勢,并能定量檢測溶液中的目標蛋白質(zhì)。雖然抗體芯片技術(shù)仍處在初期研究中,但其表現(xiàn)出靈敏度高,特異性好、操作簡單及篩選高通量等優(yōu)點,為法醫(yī)毒物檢測、戒毒監(jiān)測提供了一種新的檢測手段[3]。4.2抗體芯片在慢性腎臟病患者尿液細胞因子檢測中的應(yīng)用各種慢性腎臟病進行性發(fā)展的共同結(jié)局是終末期腎病(ESRD),ESRD已成為嚴重威脅人類健康的常見病,目前的腎臟替代治療雖然獲得了長足的進步,但是ESRD仍有較高的死亡率,其治療費用已成為嚴重的社會負擔。如何早期發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病(CKD)并采取有效措施延緩其進展至ESRD,已成為人類面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。CKD慢性進展的實質(zhì)是腎臟纖維化,研究已經(jīng)證實它與腎臟產(chǎn)生的多種細胞因子、生長因子的作用有關(guān),然而臨床上尚缺乏早期、動態(tài)監(jiān)測腎臟纖維化進程的有效方法。蛋白組學時代的到來以及相關(guān)技術(shù)的出現(xiàn),為我們探討此問題提供了嶄新的技術(shù)平臺。應(yīng)用一種全新的蛋白組學技術(shù)——抗體芯片技術(shù)檢測CKD患者尿液中細胞因子的變化。應(yīng)用Raybiotech人類細胞因子抗體芯片,依據(jù)試劑盒中操作手冊進行操作,同時檢測各組尿液中細胞因子水平。在此基礎(chǔ)之上,選取2種有表達差異的細胞因子,應(yīng)用經(jīng)典的ELISA方法進行定量分析,以驗證細胞因子抗體芯片技術(shù)的可靠性。抗體芯片技術(shù)能夠高通量、平行性檢測尿液中多種細胞因子的表達水平?？贵w芯片所得到的半定量數(shù)據(jù)能夠真實反應(yīng)尿液細胞因子的水平?？贵w芯片檢測結(jié)果提示CKD患者尿液中細胞因子表達水平同正常對照組有明顯差異并且同疾病所處階段有一定的關(guān)系?？贵w芯片技術(shù)有可能成為監(jiān)測慢性腎臟病進展的新型技術(shù)平臺[4]。4.3蛋白芯片技術(shù)在自身抗體檢測中的應(yīng)用通過蛋白芯片技術(shù)與間接免疫熒光法(ⅡF)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)自身抗體檢測試劑盒進行比對,驗證抗核抗體譜檢測蛋白芯片(抗SSA-52抗體、抗SSA-60抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗dsDNA抗體、抗rRNP抗體、抗著絲點抗體和抗核抗體)在臨床應(yīng)用中的敏感性和特異性.除抗Jo-1抗體陽性樣品較罕見,僅檢測陽性樣品32份,其他10種自身抗體,每種選擇各陽性樣本70份,陰性樣本294份;并對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析.結(jié)果除抗SSA52抗體和抗SSB抗體的檢測敏感度分別為95.7?和98.6?外,其他9種自身抗體的檢測敏感度均為100，除抗SSB抗體、抗RNP-68抗體、抗Scl-70抗體、抗dsDNA抗體、抗CENP-B抗體、抗核抗原提取物抗體(ANA)的檢測特異度分別為98.0?、98.0?、99.7?、99.7?、99.7?、98.3?外,其他5種自身抗體的檢測特異度均為100?.結(jié)論蛋白芯片技術(shù)檢測11種抗核抗體譜自身抗體的檢測敏感度(均＞95.0)和特異度(均＞98.0)均較高,且與ⅡF和ELISA法有較高的符合率,能滿足臨床檢測自身抗體譜的要求.此外,蛋白芯片技術(shù)檢測自身抗體時具有高通量、簡單快速、敏感度好和特異度強等優(yōu)點,值得臨床推廣應(yīng)用[5]。4.4抗體芯片在腫瘤研究中的應(yīng)用①卵巢癌腫瘤標志物的檢測：卵巢癌發(fā)病率尤其居女性生殖器官腫瘤的第2位，占婦科惡型腫瘤的25%。因其早期癥狀不明顯，不易早期診斷，所以用腫瘤標記物抗體芯片進行檢測以觀察這種檢驗方法的價值。②肝癌腫瘤標志物的檢測：用腫瘤標志物抗體芯片系統(tǒng)測定50例肝癌患者，50例乙型肝炎患者或肝硬化患者及50例正常對照人群血清中12種常見的腫瘤標記物，結(jié)果50例肝癌患者血清中有46例血清腫瘤標記物為陽性（陽性率為92%），50例乙型肝炎或肝硬化患者血清中18例血清腫瘤標記物為陽性（陽性率為36%），50例正常對照血清中有2例血清出現(xiàn)腫瘤標記物陽性（陽性率為4%），說明腫瘤標志物抗體芯片能提高肝癌診斷的準確度。③胰腺癌腫瘤標志物的檢測：用腫瘤標志物抗體芯片檢測42例胰腺癌患者，35名健康體檢者，51例胰腺良性疾病患者的12種常見的血清腫瘤標志物，結(jié)果顯示，抗體芯片檢測系統(tǒng)的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測法分別為78.6%、79.1%、64.7%、88.3%，正常人組和胰腺良性疾病組檢測結(jié)果的一致率分別達到100%和95%。說明腫瘤標志物抗體芯片對胰腺癌的診斷具有較高的可靠性。④肺癌腫瘤標志物的檢測：用腫瘤標志物抗體芯片對肺癌患者、正常人及良性腫瘤血清的CEA，NSE，CA242，CA153等腫瘤標志物進行檢測，陽性率分別為80%，3.3%，6.6%，另外，采用常規(guī)檢測儀器定量與抗體芯片檢測作比較，表明抗體芯片的反應(yīng)強度與血標本中含量具有較好的相關(guān)性。⑤白血病CD抗原（免疫組型）的檢測：

不同的白血病細胞在他們的質(zhì)膜上表達247個特定的區(qū)別抗原（CD抗原），這些抗原的檢測用流式細胞儀只能辨認3個抗原，但是運用抗體芯片能同時檢測50種甚至更多的在白細胞及白血病細胞上的CD抗原[6]。5.展望

抗體芯片技術(shù)毫無疑問在腫瘤的研究中有非常重要的應(yīng)用價值，尤其對腫瘤標志物的檢測，有助于惡性腫瘤的早期診斷、分型和治療監(jiān)測。但由于抗體芯片在技術(shù)及應(yīng)用中仍存在許多問題，未來的發(fā)展將集中在以下幾個方面:①快速、廉價、高通量的制備抗體。單克隆抗體是最重要、最普遍的，市場上可以提供幾萬個單克隆抗體，但是對大量的蛋白質(zhì)的研究還是不夠。重組抗體則具有分子量小，數(shù)目龐大，特異性高的特點，可由噬菌體抗體庫技術(shù)生產(chǎn)，可提供1011到1012種抗體。②延長保質(zhì)期，便于推廣?？贵w在包被8個月后就不能保持最佳的活性狀態(tài)，人工合成的抗體則穩(wěn)定性較高。③加大芯片攝取蛋白的數(shù)目及種類，盡可能多的捕獲蛋白組信息，實現(xiàn)高通量。④提高腫瘤標志物抗體芯片準確度，可通過聯(lián)合更多的標記物加以改進。目前國內(nèi)外學者開展了大量的研究，如對CA199、CEA、CA724的聯(lián)合腫瘤標記以及CA199、CEA、HCGA的聯(lián)合腫瘤標記制備成抗體芯片以提高對胃腸惡性疾病的診斷。參考文獻[1]呂曉娟,祁海柱,李景輝等.抗體芯片的研究進展[J].科技信息,2009,(02).[2]孫平,張逢春,張影.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的研究及應(yīng)用