丙酮酸（PA）含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

丙酮酸（PA）含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理丙酮酸（PA）通過(guò)乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。CheKine?丙酮酸（PA）含量檢測(cè)試劑盒（微量法）可檢測(cè)動(dòng)物組織、植物組織、細(xì)胞和細(xì)菌、血清（漿）等樣品中的丙酮酸含量，其原理是樣品中丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中呈紅色，該紅色化合物在520nm處有最大吸收峰。在一定的濃度范圍內(nèi)，丙酮酸含量與520nm吸光度成線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣品中丙酮酸含量。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)（能檢測(cè)520nm）·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ChromogenA：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。注意：ExtractionBuffer有毒，ChromogenA有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ChromogenB：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品制備：標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按下表所示用ExtractionBuffer將1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至70、35、17.5、8.75、4.375、2.188、1.094μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。序號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品體積ExtractionBuffer（μL）標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）Std.135μL1mg/mL46570Std.2200μLofStd.1(70μg/mL)20035Std.3200μLofStd.2(35μg/mL)20017.5Std.4200μLofStd.3(17.5μg/mL)2008.75Std.5200μLofStd.4(8.75μg/mL)2004.375Std.6200μLofStd.5(4.375μg/mL)2002.188Std.7200μLofStd.6(2.188μg/mL)2001.094注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。動(dòng)物組織：稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mLExtractionBuffer勻漿，靜置30min，4,000g，常溫離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。植物組織：稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mLExtractionBuffer勻漿，然后超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），靜置30min，4,000g，常溫離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞/細(xì)菌：收集500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，加1mLExtractionBuffer，超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），靜置30min，4,000g，常溫離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清（漿）樣品：取100μL血清（漿）加入1mLExtractionBuffer，充分混勻，靜置30min，4,000g，常溫離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零；樣本測(cè)定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列試劑）：試劑名稱(chēng)空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測(cè)定孔（μL）待測(cè)樣本0075不同濃度的Std.0750ExtractionBuffer7500ChromogenA252525混勻后，室溫靜置2minChromogenB125125125混勻，在520nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值A(chǔ)。計(jì)算相對(duì)吸光值ΔA測(cè)=A測(cè)定-A空白、ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。（空白孔只需做一管）結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計(jì)算結(jié)果）。將ΔA測(cè)帶入方程計(jì)算出y（μg/mL）。樣本丙酮酸含量計(jì)算(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算：丙酮酸含量(μg/g)=(y×V樣)÷(W×V樣÷V提取)×n=y÷W×n(2)按血清（漿）等液體體積計(jì)算：丙酮酸含量(μg/mL)=(y×V樣)÷(V液×V樣÷V提取)×n=10×y×n(3)按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：丙酮酸含量(μg/104)=(y×V樣)÷(500×V樣÷V提取)×n=y÷500×nV樣：加入的樣本體積，0.075mL；V提取：加入ExtractionBuffer體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；V液：液體樣本體積，0.1mL；500：細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量，500萬(wàn)；n：稀釋倍數(shù)。結(jié)果展示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：ΔOD520nm[PyruvateAcid(PA)ΔOD520nm[PyruvateAcid(PA)](μg/mL)Figure1.96孔板分析的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)實(shí)例：丙酮酸含量（μg/g）丙酮酸含量（μg/g）Figure2.試劑盒測(cè)定小鼠肝臟、小鼠脾臟、油桃和蘆薈中丙酮酸含量。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1120CheKine?丙酮酸激酶（PK）活性