線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶，也是線粒體電子傳遞呼吸鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。CheKine?線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性，其原理是還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收，線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ酶活性?？蓽y動、植物組織和細(xì)胞樣本。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測550nm處的吸光度）·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器或研缽試劑準(zhǔn)備ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。工作液的配制：臨用前，將ReagentⅤ和ReagentⅥ依次轉(zhuǎn)移到ReagentⅣ中混合溶解，如果檢測樣本是哺乳動物來源，請置于37℃孵育5min；如果樣本是其他物種，則置于25℃孵育5min。用不完的試劑分裝后-20℃避光保存1周，禁止反復(fù)凍融。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，以保證酶的活力。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ的提?。簻?zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬個(gè)細(xì)胞，加入1mLReagentⅠ和10μLReagentⅢ，用勻漿器或研缽冰浴勻漿。離心勻漿液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的離心管中，舍棄沉淀。再次離心上清，11,000g，10min，4℃，沉淀即為提取的線粒體，用作第5步操作。(選做)上清液即為胞漿提取物，可作為樣本用于測定從線粒體泄漏的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ，用于判斷線粒體提取效果。在沉淀中加入200μLReagentⅡ和2μLReagentⅢ，充分重懸沉淀，用于下一步線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ酶活性檢測。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀和可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm，可見分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入200μL工作液和10μL樣本，充分混勻后，立即讀取550nm處0min的初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。注意：1.為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果ΔA過高（高于1.0），可用ReagentⅡ稀釋樣本后再測定，計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高檢測數(shù)值，若ΔA出現(xiàn)負(fù)值，則說明樣本中不含復(fù)合體Ⅳ或已降解。2.線粒體呼吸鏈試劑盒是酶動力學(xué)原理的試劑盒，反應(yīng)比較快，且反應(yīng)趨于平衡之后，該可逆反應(yīng)可能會出現(xiàn)負(fù)反應(yīng)，建議如下：（1）樣本組數(shù)：2-3個(gè)左右，該酶促反應(yīng)速度快，且為酶促反應(yīng)，需要把握好起始時(shí)間點(diǎn)和反應(yīng)后的時(shí)間點(diǎn)；（2）儀器提前預(yù)熱，且加樣可安排在酶標(biāo)儀旁邊進(jìn)行，加樣混勻后直接放入；（3）如果ΔA偏小，可增加樣本量（組織克重或者細(xì)胞數(shù)量），或者減少提取液用量；（4）樣本盡量新鮮提取，如果不能馬上使用，則把完整細(xì)胞或者分裝的組織保存在-80℃，一個(gè)月內(nèi)使用；（5）工作液臨用前配制。3.該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1890的測定。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。1.使用96孔板測定的計(jì)算公式(1)按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。上清中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算：上清的復(fù)合體Ⅳ活力(U/g鮮重)=[ΔA上清×V反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=2,221×ΔA上清÷W沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算:沉淀中的復(fù)合體Ⅳ活力(U/g鮮重)=[ΔA沉淀×V反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V重懸×V樣)÷T=444×ΔA沉淀÷W復(fù)合體Ⅳ總活力的計(jì)算：總復(fù)合體Ⅳ活力即為上清中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活力與沉淀中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活力之和?？倧?fù)合體Ⅳ活力(U/g鮮重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W(2)按細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活力(U/104cells)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V重懸×500)÷T=0.888×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2.1×10-4L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，19.1×103mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；109：單位換算系數(shù)，1mol=109nmol；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；ΔA上清：上清測定值；W：樣本重量，g；V提?。禾崛◇w系體積，1.01mL；ΔA沉淀：沉淀測定值；V重懸：重懸沉淀體積，0.202mL；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬。2.使用微量玻璃比色皿進(jìn)行測定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計(jì)算即可。結(jié)果展示實(shí)驗(yàn)實(shí)例：取0.1g小鼠腦組織進(jìn)行樣本處理，按照測定步驟操作，用96孔板測得：ΔA上清=A1-A2=0.4568-0.4446=0.0122，ΔA沉淀=A1-A2=0.4373-0.4188=0.0185按樣本質(zhì)量計(jì)算得：上清中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性(U/g鮮重)=2,221×ΔA上清÷W=2,221×0.0122÷0.1=270.962U/g沉淀中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性(U/g鮮重)=444×ΔA沉淀÷W=444×0.0185÷0.1=82.14U/g則線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ(U/g鮮重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W=270.962+82.14=353.102U/g相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1850CheKine?線