《HPLC基本原理》課件

HPLC基本原理高效液相色譜(HPLC)是一種強大的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。HPLC利用流動相通過固定相分離混合物中的不同組分，通過檢測器測量每個組分的濃度。HPLC是什么?高效液相色譜一種現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)。用于分離、識別和定量樣品中的不同組分。廣泛應(yīng)用醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)境等領(lǐng)域。進行成分分析、純化、質(zhì)量控制等。分離原理利用樣品組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)差異。實現(xiàn)對樣品中不同組分的有效分離。HPLC的發(fā)展歷程120世紀60年代高效液相色譜(HPLC)的雛形誕生。220世紀70年代HPLC技術(shù)迅速發(fā)展。320世紀80年代HPLC成為一種成熟的分析技術(shù)。421世紀HPLC廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。HPLC的發(fā)展歷程可以追溯到20世紀60年代，當(dāng)時人們開始使用高壓泵和高效色譜柱進行分離分析。隨著技術(shù)的不斷進步，HPLC逐漸成為一種成熟的分析技術(shù)，并在各個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。HPLC的基本組成泵系統(tǒng)高壓輸送流動相，確保恒定流速，為色譜分離提供動力。樣品注入系統(tǒng)將樣品精確、快速地注入色譜柱，確保樣品溶液的快速轉(zhuǎn)移。色譜柱根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇，實現(xiàn)對不同物質(zhì)的分離。檢測器監(jiān)測流出液中各組分的濃度，并將其轉(zhuǎn)化為電信號。泵系統(tǒng)HPLC泵是系統(tǒng)的心臟，負責(zé)將流動相輸送到色譜柱。泵需要提供恒定、可控的流動相流速，確保分離過程的穩(wěn)定性。HPLC泵通常使用高壓，可達數(shù)千磅/平方英寸，以克服色譜柱的阻力。樣品注入系統(tǒng)樣品注入系統(tǒng)是將樣品引入色譜柱的裝置。常用的注入方式有手動注射器注入和自動進樣器注入。手動注射器注入操作簡單，但精度較低。自動進樣器注入精度高，可重復(fù)性好，適用于高通量分析。樣品注入系統(tǒng)應(yīng)能精確控制樣品體積和注入速度，保證樣品快速、完全地進入色譜柱。此外，樣品注入系統(tǒng)還應(yīng)具有良好的密封性，避免樣品泄漏或污染。色譜柱色譜柱類型色譜柱類型多種多樣，根據(jù)填料類型、尺寸、長度等特點，分為反相色譜柱、正相色譜柱、離子交換色譜柱等。填料色譜柱的核心是填料，不同的填料具有不同的極性、粒徑、孔徑等，影響著分離效果和效率。色譜柱安裝色譜柱需要正確安裝，連接管道要緊密，防止泄漏，延長色譜柱使用壽命。淋洗液和淋洗梯度淋洗液淋洗液是HPLC系統(tǒng)中的流動相，它負責(zé)將樣品中的組分帶入色譜柱，并通過柱子的分離作用進行分離。淋洗強度淋洗強度是指淋洗液將組分從色譜柱上洗脫下來的能力，它主要取決于淋洗液的極性和溶解能力。淋洗梯度淋洗梯度是指在HPLC分析過程中，改變淋洗液的組成或強度，以優(yōu)化分離效果。檢測器檢測器概述檢測器是HPLC系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分，負責(zé)檢測流出液中組分的含量并將其轉(zhuǎn)換為信號。檢測器的工作原理是根據(jù)組分的物理化學(xué)性質(zhì)，例如紫外吸收、熒光、電化學(xué)性質(zhì)等，來識別并量化組分。檢測器的作用檢測器可以提供有關(guān)樣品組分的信息，例如濃度、含量、保留時間等。這些信息可以用于定量分析和定性分析，以及識別樣品中的未知組分。檢測器的種類11.紫外檢測器最常用的HPLC檢測器，適用于具有紫外吸收的化合物。22.熒光檢測器靈敏度高，適用于具有熒光性質(zhì)的化合物。33.電化學(xué)檢測器對氧化還原活性物質(zhì)敏感，適合分析電化學(xué)活性物質(zhì)。44.質(zhì)譜檢測器提供化合物分子量信息，用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。紫外檢測器紫外檢測器是HPLC中最常用的檢測器之一。它基于物質(zhì)對紫外光的吸收特性，檢測樣品中組分的濃度。紫外檢測器靈敏度高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用廣泛。熒光檢測器熒光檢測器是一種靈敏度很高的檢測器，它利用物質(zhì)的熒光特性來檢測分析物。當(dāng)分析物通過激發(fā)光束照射后，激發(fā)態(tài)分子會發(fā)射出熒光，檢測器可以測量熒光的強度，從而確定分析物的濃度。熒光檢測器適用于檢測具有熒光特性的物質(zhì)，如多環(huán)芳烴、維生素、蛋白質(zhì)等。電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器通過測量被分析物在電極上的氧化還原反應(yīng)電流來進行檢測。電化學(xué)檢測器靈敏度高，適用于電活性物質(zhì)的檢測，例如兒茶酚胺、維生素、藥物等。質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器是一種非常靈敏的檢測器，可用于HPLC分析。該檢測器通過測量離子的質(zhì)量與電荷比來識別和定量樣品中的化合物。質(zhì)譜檢測器可以提供有關(guān)樣品中化合物結(jié)構(gòu)的信息。HPLC分析的步驟1樣品制備首先，需要對樣品進行預(yù)處理，例如過濾、提取、濃縮等，以去除雜質(zhì)，使樣品適合HPLC分析。2樣品注入將處理后的樣品注入到HPLC系統(tǒng)中，通過高壓泵將其送入色譜柱。3分離樣品中的不同組分在色譜柱中被分離，根據(jù)組分在固定相和流動相之間的親和力不同，分離速度也不同。4檢測分離后的組分通過檢測器，檢測器會根據(jù)組分的物理化學(xué)性質(zhì)，如紫外吸收、熒光發(fā)射等，產(chǎn)生信號。5數(shù)據(jù)分析檢測器產(chǎn)生的信號被記錄并轉(zhuǎn)換為色譜圖，通過分析色譜圖可以得到樣品中各組分的含量、保留時間等信息。色譜圖分析保留時間保留時間是樣品組分從進樣到檢測器的時間，用于定性分析。峰的高度和面積峰的高度和面積反映了組分的濃度，用于定量分析。峰的分離度峰的分離度是指相鄰峰之間的距離，表示分離效果的好壞。保留時間保留時間是指樣品從進樣器進入色譜柱到在檢測器中被檢測到的時間，是HPLC分析中重要的參數(shù)之一。保留時間可以反映樣品在色譜柱中的保留程度，以及樣品與流動相之間的相互作用力。峰的高度和面積峰的高度和面積是HPLC分析中重要的參數(shù)，它們反映了樣品中分析物的含量。峰高指的是色譜峰的最高點與基線的垂直距離，峰面積則是色譜峰與基線所圍成的面積。1峰高與進樣量和檢測器靈敏度有關(guān)。2峰面積與分析物在色譜柱上的保留時間和濃度成正比。色譜峰的理論塔板數(shù)塔板數(shù)是衡量色譜柱分離效率的重要指標。塔板數(shù)越高，峰越窄，分離效果越好。塔板數(shù)色譜峰的形狀分離效果高窄好低寬差分離度定義相鄰兩個色譜峰之間的分離程度公式Rs=2(tR2-tR1)/(W1+W2)含義分離度越大，峰形越尖銳，分離效果越好選擇性因子選擇性因子是指在色譜分離中，不同組分在固定相上的保留能力差異，它反映了色譜柱對不同組分的分離能力。選擇性因子越大，說明色譜柱對不同組分的分離能力越強，分離效果越好。選擇性因子可以通過計算兩個組分在色譜柱上的保留時間比值來獲得。選擇性因子與流動相的組成、色譜柱的性質(zhì)、溫度等因素有關(guān)，可以通過調(diào)整這些因素來改變選擇性因子，進而優(yōu)化色譜分離效果。分析方法的優(yōu)化方法開發(fā)根據(jù)待測樣品特點，選擇合適的色譜柱、流動相和檢測器，建立初步分析方法。方法驗證驗證方法的準確性、精密度、線性范圍、檢測限等參數(shù)，確保方法的可靠性和可重復(fù)性。方法優(yōu)化通過調(diào)整流動相組成、流速、柱溫等參數(shù)，改善分離效果，提高分析效率。方法轉(zhuǎn)移將優(yōu)化后的分析方法轉(zhuǎn)移到其他儀器或?qū)嶒炇?，確保方法的通用性和可移植性。影響HPLC分離的因素色譜柱色譜柱的類型、尺寸和填料對分離效果影響很大。例如，不同填料的孔徑、粒徑和表面化學(xué)性質(zhì)會影響樣品與填料的相互作用。流動相流動相的組成、pH值、極性、粘度和流速都會影響樣品在色譜柱中的遷移速度和分離效果。溫度溫度影響樣品和流動相的擴散系數(shù)，從而影響分離效果。溫度過高會導(dǎo)致峰展寬，而溫度過低會導(dǎo)致分離時間延長。樣品注入量樣品注入量過大會導(dǎo)致峰展寬，影響分離效果。樣品注入量過小則會導(dǎo)致峰面積過低，難以檢測。色譜柱的選擇1固定相選擇固定相類型，根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)選擇正相或反相色譜柱。2填料粒徑小粒徑填料提高分離效率，但會增加阻力，需根據(jù)具體情況選擇。3柱長柱長影響分離時間，一般較長柱可以提高分離度，但延長分析時間。4柱內(nèi)徑內(nèi)徑?jīng)Q定進樣量，需根據(jù)分析目標選擇合適的柱內(nèi)徑。流動相的選擇極性匹配流動相的極性應(yīng)與固定相的極性相匹配，以實現(xiàn)最佳分離效果。如果流動相的極性與固定相的極性太相似，則樣品組分將不會被有效地分離。溶解度流動相應(yīng)能夠溶解樣品組分，使其能夠進入色譜柱。如果樣品組分在流動相中不溶解，則無法進行有效分離。流速的選擇流速的影響流速會影響樣品在色譜柱中的遷移速度，進而影響分離效果。流速的選擇流速過快會導(dǎo)致分離度降低，過慢則會延長分析時間。優(yōu)化流速需要根據(jù)樣品性質(zhì)、色譜柱類型和流動相選擇合適的流速。柱溫的選擇11.影響分離度柱溫影響溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)，進而影響分離度。22.降低峰擴散升高柱溫可以降低溶質(zhì)在色譜柱中的擴散，使峰形更尖銳。33.縮短分析時間升高柱溫可以加快溶質(zhì)的遷移速度，縮短分析時間。44.優(yōu)化流動相根據(jù)實際情況，需要選擇合適的柱溫以達到最佳分離效果。HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域藥物分析HPLC用于藥物開發(fā)和質(zhì)量控制，包括藥物成分分析、雜質(zhì)鑒定、藥物穩(wěn)定性研究等。食品安全