（高清版）DB37∕T 3122-2018 槐花多糖提取工藝及其生物活性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程　

ICS67.050DB37DB37/T3122—2018槐花多糖提取工藝及其生物活性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程BiologicalActivityEvaluation2018-022018-02-2018-03-山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3122—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：朱瑞良、魏凱、胡莉萍、孫振紅、黃河、郝智慧、閆振貴、王慧軍、裴宗飛。1DB37/T3122—2018槐花多糖提取工藝及其生物活性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程本規(guī)程規(guī)定了槐花多糖提取工藝及其生物活性評(píng)價(jià)技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、試劑或材料、儀器設(shè)備、槐花多糖的提取、苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量和生物活性評(píng)價(jià)等標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)程適用于槐花多糖用作動(dòng)物用免疫佐劑和免疫增強(qiáng)劑的制備和檢驗(yàn)。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。當(dāng)中的主要抗體。在腸道黏膜免疫當(dāng)中起到關(guān)鍵作用的是分泌型免疫球蛋白A(Secretory血凝試驗(yàn)(hemagglutinationtest,HA)是指某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱(chēng)為血凝，也稱(chēng)直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱(chēng)血凝試驗(yàn)。血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutinationinhibitiontest,HI)是指當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲兀瑒t紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|，這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱(chēng)為血凝抑制，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱(chēng)血凝抑制試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA2DB37/T3122—20184.1牛血清白蛋白(BSA),配制方法見(jiàn)附錄A。4.8磷酸鹽緩沖溶液(PBS),配制方法見(jiàn)附錄A。4.1296孔ELISA酶標(biāo)板。5.340目篩網(wǎng)。5.16分光光度計(jì)(380nm～780nm)。3DB37/T3122—20186槐花多糖的提取6.1采集新鮮盛開(kāi)的槐花，去梗后放入恒溫干燥箱中于70℃烘干，用超微粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，過(guò)6.2稱(chēng)取一定量的槐花粉與去離子水按體積1:25混合，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至4.5,加入終濃度0.25%的纖維素酶，45℃水浴中浸提1h,提取4次，合并4次上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5體積。6.3濃縮液用Sevag試劑(配制方法見(jiàn)附錄A)除蛋白，重復(fù)兩次，最后加入4倍體積的無(wú)水乙醇使多糖沉淀，對(duì)析出的多糖進(jìn)行離心，冷凍干燥后即為槐花多糖。7.290%苯酚液的配制量取苯酚90mL,用去離子水定容至100mL,即得90%苯酚液，棕色瓶中避光保存。7.36%苯酚液的配制將90%苯酚液稀釋至6%,即一體積儲(chǔ)存液對(duì)應(yīng)十四體積去離子水，臨用現(xiàn)配。取8支干凈的帶塞試管，按表1方法分別加入相應(yīng)體積的葡萄糖溶液，然后在冰水浴中加入0.5mL的6%苯酚溶液，震蕩搖勻后緩慢逐滴加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜，搖勻后恒溫加塞，沸水放置20min,取出后用涼水冷卻10min,以0號(hào)作為空白調(diào)零，在最大吸收波長(zhǎng)處(490nm)測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)(μg/mL),吸光度Y歸方程。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作的試劑配制方法管號(hào)01234567葡萄糖(mL)苯酚液(mL)濃硫酸(mL)7.4.2待測(cè)樣品多糖含量的測(cè)定與計(jì)算將提取得到的待測(cè)多糖用去離子水溶解，定容至100mL,取溶解后的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測(cè)定方法，以樣液為參比液，測(cè)定溶液的吸光值，按回歸方程計(jì)算待測(cè)溶液的多糖濃度，乘以稀釋倍數(shù)則為多糖含量。4DB37/T3122—2018用苯酚-硫酸法測(cè)的多糖含量大于80%以上，視為提取的槐花多糖合格。8.1槐花多糖對(duì)雞免疫功能的增強(qiáng)作用檢測(cè)將240只SPF雛雞，隨機(jī)分為4組，每組60只。I、Ⅱ、Ⅲ組為試驗(yàn)組，于9~12日齡，每天頸部皮下注射0.25mL槐花多糖溶液。其中I、Ⅱ、Ⅲ組槐花多糖含量分別為200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL,IV組為對(duì)照組，注射生理鹽水。12日齡時(shí)各組免疫雞新城疫滅活苗，于免疫后3d、7d、14d、21d,采樣檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)雞的飼養(yǎng)符合GB14925的要求。免疫7天后，各組隨機(jī)取15只雛雞，稱(chēng)量體重(稱(chēng)重前12h停飼停水),剖殺前采集血液(檢測(cè)后續(xù)指標(biāo)用),分別摘取胸腺、法氏囊、脾臟并稱(chēng)重，計(jì)算出胸腺指數(shù)[胸腺重(g)/活體重(kg)],法氏囊指數(shù)[法氏囊重(g)/活體重(kg)],脾臟指數(shù)[脾臟重(g)/活體重(kg)]。8.3血清抗體效價(jià)的檢測(cè)免疫后3d、7d、10d、14d、21d,采集各組雛雞的血液，在37℃溫箱靜置2h,分離血清，用血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)檢測(cè)雛雞血清抗體水平。血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)依據(jù)GB/T14926.54。用一次性醫(yī)用抗凝管采集各組雛雞的抗凝血1mL,用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定雛雞血液內(nèi)白細(xì)胞8.5小腸內(nèi)分泌型免疫球蛋白A(SlgA)含量的測(cè)定雛雞剖殺后，取10cm長(zhǎng)的十二指腸段，用3mL1%BSA-PBS反復(fù)沖洗3次后，8000rpm離心取上清，用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)上清中SIgA的含量。5DB37/T3122—2018AA(資料性附錄)溶液的配制將100mg的牛血清白蛋白加入9.5mL水中(須將蛋白加入水中，而不是將水加入蛋白中),蓋好蓋后，輕輕搖動(dòng)，直至牛血清白蛋白完全溶解為止。加水定容到10mL,然后分裝成小份貯存于-20℃。氯仿：正丁醇=5:1(V/V)混合。A.3磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的配制取ZLI-9061PBS溶于1000mL的蒸餾水中，混勻，測(cè)pH值應(yīng)在7.2~7.4之間，若偏離此范圍，請(qǐng)用雞或未進(jìn)行過(guò)任何免疫過(guò)的成年公雞血液，采血時(shí)按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素或枸椽酸鈉等。A.4.2采血完畢后最好分裝至2mL容量的圓底離心管中，經(jīng)2000r/min~3000