（高清版）DB37∕T 3129.1-2018 鴨細小病毒感染診斷技術(shù) 第1部分：病毒分離鑒定　

DB37/T3129.1—2018鴨細小病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒2018-02-02發(fā)布2018-03-02實施IDB37/T3129.1—2018本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學。本標準起草人：刁有祥、陳浩、唐熠、楊晶。1DB37/T3129.1—2018鴨細小病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定本標準規(guī)定了鴨細小病毒樣品的采集與保存、病毒的分離和鑒定等的技術(shù)要求。本標準所規(guī)定的鴨細小病毒分離鑒定和PCR檢測方法適用于鴨組織、分泌物、排泄物和病毒培養(yǎng)物中鴨細小病毒分離鑒定及其核酸檢測。PCR方法還適用于該病的的實驗室診斷、監(jiān)測和流行病學調(diào)查等。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫3術(shù)語和定義下列定義和術(shù)語適用于本文件。鴨細小病毒Duckparvovirus也稱新型鵝細小病毒，是引起鴨短喙侏儒綜合征的病原，該病以生長障礙，短喙、舌外露為特征。用對應某一種抗原的抗體(這里被稱為一抗)與細胞孵育結(jié)合，在采用對應一抗(也就是抗一抗)的抗體(這里被稱為二抗，二抗上偶聯(lián)有熒光素分子)與細胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光信號為陽性反應。采用胰酶消化法，用15日齡~20日齡SPF鴨胚肝臟制備的原代細胞。4實驗室質(zhì)量控制2DB37/T3129.1—20184.2從事PCR工作的實驗室盡可能分區(qū)，根據(jù)條件劃分出前處理區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴增區(qū)、電泳檢測區(qū)，盡可能形成有效的物理隔離，且為單一流向，不得倒流。特別注意電泳后的瓊脂凝膠要及時處理，避免對實驗室造成污染。病毒分離區(qū)域的雞胚接種操作區(qū)和細胞培養(yǎng)操作區(qū)也應遵循一定的布局原則，避免交叉污染。4.3注意個人防護和環(huán)境保護，電泳中用到的EB可誘發(fā)基因突變，試驗中被EB污染的物品要有專用收集處，并通過適當?shù)姆绞?如焚燒、或送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司)進行無害化處理。4.4生物樣品應嚴格控制對環(huán)境的污染，試驗結(jié)束后應將相關(guān)樣品收集高壓滅菌后，送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司做最終處理。4.5人員操作人員應接受實驗室生物安全、實驗室質(zhì)量管理、細胞培養(yǎng)和分子生物學實驗室檢測技術(shù)培訓。熟悉生物樣品處理、細胞培養(yǎng)、以及核酸提取、基因擴增等分子生物學技術(shù)。4.5.1儀器設備a)生物安全柜；c)CO?恒溫培養(yǎng)箱(37℃恒溫);d)臺式低溫高速離心機(最大轉(zhuǎn)速12000r/min);e)電泳儀；f)電泳槽；g)紫外凝膠成像儀；h)2°C～8°C冰箱；j)微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭；k)孵化器(37℃恒溫);4.5.2試劑和材料d)dNTPs(2.5mmol/L);e)1.5%瓊脂糖凝膠，見A.1;f)1×TAE緩沖液，見A.2;g)溴化乙錠(10μg/μL),見A.3;h)核酸電泳加樣緩沖液，見A.4;i)DNA分子量標準，要求在100bp~2000bp之間，有5條以上的指示條帶；j)已知的鴨細小病毒液陽性對照標準品；k)健康鴨組織或細胞作為陰性對照標準品；1)固定液，甲醇：丙酮=1:1(V/V);3DB37/T3129.1—2018n)細胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的p)細胞維持液(含1%胎牛血清的上游引物5455F:5'-GAGCATCAACTCCCGTATGTCC-3';下游引物5371R:5'-CTACTTCCTGCTCGTCCGTGA-3';擴增目的片段長度為661bp;引物濃度均為50μmol/L。5.1樣品的采集采集死亡鴨肝臟、脾和腦等組織，分別處理或混合后進行處理；若是活鴨，則采集泄殖腔拭子。樣品置于在密閉容器中冷藏運輸，儲藏溫度不超過4℃,時間不超過24h。5.2樣品的保存5.2.1室溫條件下樣品在1h~2h內(nèi)處理完畢，未能及時處理的樣本在4℃冰箱中存放，不超過24h;也可于-20℃低溫條件下保存，不超過30d;-70℃貯存最佳，不超過1年。5.2.2組織研磨液和泄殖腔拭子懸液置于-20℃低溫條件下保存，不超過2周；-70℃貯存不超過30d。5.3樣品的處理5.3.1在生物安全柜中，取10g~20g樣品放入滅菌的研缽中，無菌條件下磨碎。5.3.2用含有抗生素(青霉素(2000IU/mL)、鏈霉素(2mg/mL)、慶大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL))等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.0~7.4,附錄A.1)配成10%～20%(g/mL)的懸液；泄殖腔拭子懸液中抗生素濃度提高5倍。加入抗生素后pH調(diào)至7.0~7.4。5.3.3樣本組織懸液反復凍融3次，經(jīng)8000r/min離心10min,取上清并置4℃過夜，次日接種SPF6病毒分離6.1.1將處理后的樣品上清，每份尿囊腔接種9日齡~11日齡SPF鴨胚3枚~5枚，0.2mL/胚，37℃孵化120h。6.1.2棄去24h內(nèi)死亡胚，24h~120h內(nèi)死亡和存活鴨胚置4℃冰箱過夜或-20℃冷凍1h,分別無菌收集尿囊液并進行無菌檢查，無菌尿囊液盲傳三代。6.2細胞接種6.2.1將處理后的樣品上清接種80%生長狀況良好的單層原代鴨胚肝細胞，5%CO?、37℃孵育1h,吸棄上清，用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，吸棄后加入細胞維持液。6.2.2當70%以上單層細胞出現(xiàn)細胞病變時，將細胞培養(yǎng)物凍融后，轉(zhuǎn)移至2mL凍存管置于-70℃保存，不超過3年。4DB37/T3129.1—2018取接種病毒60h的鴨胚肝細胞(24孔細胞培養(yǎng)板),用PBS緩沖液輕輕洗滌3次～4次，吸棄液體。加入預冷(-20℃)的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL/孔沒過單層細胞，置于-20℃固定10min,吸棄固定液，自然晾干后，用PBS緩沖液洗滌3次。將兔抗細小病毒多克隆抗體用抗體稀釋液(PBST,見附錄B.3)作1:200稀釋，每孔加入100μL,置加入1:200(抗體稀釋液PBST)稀釋的FITC標記鼠抗兔抗體(100μL/孔),置于濕盒中4℃孵育1h。吸棄后用PBS緩沖液洗滌3次。注意避光操作。加入數(shù)滴50%甘油鹽水封片(見附錄B.2),置于倒置熒光顯微鏡下，觀察是否有綠色熒光信號。應隨時檢測，否則應于-20℃7.2.2.1以提取的樣品DNA為模板，用PCR進行擴增。7.2.2.2PCR反應體系：10×PCRBuffer2.5μ和5861R(100μmol/L)各0.5μL、DNA模板3μL、rTaqDNA聚合酶0.25μL,加H20至25μL。7.2.2.3PCR反應條件：94℃預變性5min;94℃30s、58℃45s、72℃30s,進行30個循環(huán)，72℃延伸10min。7.2.3PCR產(chǎn)物電泳7.2.3.1取9μL樣品與1μL核酸電泳加樣緩沖液混勻后，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在位于凝膠7.2.3.2加樣后，按照5V/cm電壓，電泳20min~40min,當加樣緩沖液中溴酚藍電泳過半至凝膠下2/5處時，可停止電泳。7.2.3.3置于凝膠成像儀下觀察，根據(jù)分子量標準判斷PCR擴增產(chǎn)物大小。每次檢測，至少設置一個或一個以上的陰性對照標準品和陽性對照標準品。8.1鴨胚肝細胞感染鴨細小病毒，細胞輕微聚集，IFA檢測出現(xiàn)綠色熒光信號。當陽性對照IFA檢測顯示出現(xiàn)綠色熒光信號，陰性對照未出現(xiàn)熒光信號時，檢測結(jié)果成立，見資料性附錄C。8.2樣品檢測孔出現(xiàn)綠色熒光信號表明樣品中存在鴨細小病毒，陰性樣品中無鴨細小病毒。5DB37/T3129.1—20188.3陽性對照出現(xiàn)預期長度的擴增條帶，且陰性對照無此擴增條帶時，判定檢測有效；否則判定檢測結(jié)果無效，不能進行判斷。8.4在陽性對照出現(xiàn)目的擴增條帶，陰性對照無條帶出現(xiàn)(引物二聚體除外)時，試驗成立。PCR檢測結(jié)果為陽性表明樣品中存在鴨細小病毒，檢測結(jié)果為陰性時表明樣品中不存在鴨細小病毒，見資料性6DB37/T3129.1—2018(資料性附錄)相關(guān)試劑的配制A.11.5%瓊脂糖凝膠的配制試劑類型試劑含量瓊脂糖1.5g0.5×TAE電泳緩沖液加至100mL微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃時加入溴化乙錠(EB)溶液5μL,搖勻。倒入電泳板上，凝固后，取下梳子，備用。A.21×TAE電泳緩沖液的配制A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0)試劑類型試劑含量乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?·2H?O)滅菌雙蒸水80.0mL氫氧化鈉調(diào)pH至滅菌雙蒸水加至用于配制A.2.2中的50×TAE電泳緩沖液A.2.2配制50×TAE電泳緩沖液試劑類型試劑含量羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰醋酸EDTA-Na2溶液(pH8.0)滅菌雙蒸水加至用于配制A.2.3中的1×TAEA.2.3配制1×TAE電泳緩沖液試劑類型試劑含量50×TAE電泳緩沖液滅菌雙蒸水加至A.3溴化乙錠的配制試劑類型試劑含量溴化乙錠滅菌雙蒸水加至7DB37/T3129.1—2018試劑類型試劑含量聚蔗糖溴酚藍0.1g二甲苯青0.1g滅菌雙蒸水8DB37/T3129.1—2018(資料性附錄)試劑類型試劑含量雙蒸餾水加至