生物化學(xué) DNA的復(fù)制修復(fù)和重組 1

DNA的復(fù)制，修復(fù)和重組

DNA

Replication，Repair，and

Recombination1上節(jié)課內(nèi)容：核酸的分解過(guò)程：核酸→核苷酸→核苷+磷酸→嘌呤堿和嘧啶堿+戊糖-1-磷酸核苷酸酶：水解核苷酸生成核苷和磷酸

核苷磷酸化酶將核苷和磷酸轉(zhuǎn)化成游離堿基和戊糖-1-磷酸，反應(yīng)是可逆的嘌呤分解：尿酸

腺嘌呤轉(zhuǎn)化成次黃嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤脫氨反應(yīng)也可在核苷或核苷酸水平上發(fā)生嘌呤的分解主要在肝臟、小腸及腎臟中正常人血漿中尿酸的含量為20～60mg/L，超過(guò)80mg/L時(shí)，尿酸鹽晶體沉積于關(guān)節(jié)、軟組織、軟骨及腎而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、尿路結(jié)石和腎病，稱痛風(fēng)癥

別嘌呤醇，與次黃嘌呤結(jié)構(gòu)非常類似，在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)換為別黃嘌呤，是黃嘌呤脫氫酶的一個(gè)很強(qiáng)的抑制劑，可防止非正常的高水平的尿酸的形成

嘧啶分解：產(chǎn)物易溶于水

β-丙氨酸或β-氨基異丁酸

嘧啶的降解主要在肝臟進(jìn)行胞嘧啶→尿嘧啶→二氫尿嘧啶→β-脲基丙酸→β-丙氨酸→乙酰CoA→TCA胸腺嘧啶→二氫胸腺嘧啶→β-脲基異丁酸→β-氨基異丁酸→琥珀酰CoA→TCA

2核苷酸合成的基本途徑1.有從頭合成和補(bǔ)救合成兩條基本途徑。2.肝組織主要進(jìn)行從頭合成，而腦、骨髓、紅細(xì)胞等只能進(jìn)行補(bǔ)救合成。新生及年輕組織的內(nèi)源性核苷酸從頭合成比例大；而衰老組織及肝功能降低時(shí)，補(bǔ)救合成比例增大。

核苷酸的合成

3新陳代謝，中間代謝，物質(zhì)代謝，能量代謝，食物的卡價(jià)，呼吸商，基礎(chǔ)代謝體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)在三種不同水平上進(jìn)行：(1)細(xì)胞或酶水平調(diào)節(jié)

(2)激素調(diào)節(jié)

(3)神經(jīng)調(diào)節(jié)其中酶的調(diào)節(jié)是最基本的調(diào)節(jié)方式，是一切調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。酶的調(diào)節(jié)是通過(guò)控制酶的活性和酶的合成量代謝抑制劑抗代謝物目錄Section1.

引言Section2.本章背景Section3.基于DNA的DNA復(fù)制Section

4.

DNA的損傷及修復(fù)Section

5.

基于RNA的DNA的復(fù)制Section

6.

DNA的重組45Section1.

?（Introduction）現(xiàn)代生物學(xué)的三大基石：1838-1839年細(xì)胞學(xué)說(shuō)1859年達(dá)爾文進(jìn)化論1866年孟德?tīng)栠z傳學(xué)達(dá)爾文孟德?tīng)柺┩┤R登6生物化學(xué)的三大階段：1890-1930年生命的分子基礎(chǔ)1930-1950年生物的氧化和代謝1950年-

生命的遺傳信息流動(dòng)分子生物學(xué)（Molecular

Biology）生物化學(xué)（Biochemistry）遺傳學(xué)（Genetics）7分子生物學(xué)三大基石及簡(jiǎn)史：1941年比德?tīng)柡退啬诽岢隽恕耙粋€(gè)基因，一個(gè)酶”學(xué)說(shuō)。基因的功能在于決定酶的結(jié)構(gòu)，且一個(gè)基因僅決定一個(gè)酶的結(jié)構(gòu)。1953年沃森和克里克提出了DNA的反向平行雙螺旋結(jié)構(gòu)。提出的中心法則，描述了遺傳信息從基因到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的流動(dòng)。1961年雅各布和莫諾提出了操縱子的概念。解釋了原核基因表達(dá)的調(diào)控。比德?tīng)査啬肺稚死锟搜鸥鞑寄Z8核心：中心法則（Central

Dogma）91869年Miescher發(fā)現(xiàn)了核酸及核酸的主要成分是DNA。Miescher101928年FrederickGriffith肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。證明有轉(zhuǎn)化因子的存在。FrederickGriffith

111944年Oswald

Avery體外肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化，噬菌體侵染試驗(yàn)。證實(shí)了遺傳物質(zhì)是DNA而不是蛋白質(zhì)。121941年比德?tīng)柾啬泛献麈滄呔鷮?shí)驗(yàn)。比德?tīng)柡退啬氛J(rèn)為：所有生物體內(nèi)的一切生物化學(xué)過(guò)程最終都由基因控制;這些過(guò)程都可細(xì)分為一系列化學(xué)反應(yīng);各個(gè)反應(yīng)均以某種方式受單個(gè)基因的控制;單個(gè)基因的突變只能改變細(xì)胞進(jìn)行某一化學(xué)反應(yīng)的能力。比德?tīng)査啬?31951年X~rayphotographofDNAwithhighqualityM.H.F.Wilkins141951年

JamesWatson和FrancisCrick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。151958，MatthewMeselsonandFranklinStahl證明在細(xì)菌中DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制。161961年FrancoisJacob和SydneyBrenner發(fā)現(xiàn)核糖體是翻譯必須的。不同的mRNA在核糖體作用下會(huì)生成不同的蛋白。171960s

MarshallNirenberg；GobindKhorana；RobertW.Holley對(duì)遺傳密碼子及蛋白合成的功能進(jìn)行了研究。MarshallNirenbergGobindKhoranaRobertW.Holley181970.

HowardTemin；DavidBaltimore發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄HowardTeminDavidBaltimore191983.BarbaraMcClintock在1948年的轉(zhuǎn)座現(xiàn)象被授予諾貝爾獎(jiǎng)

DNAtransposableelementBarbaraMcClintock

20TheNobelPrizeinChemistry1989：Altman和Cech的核酶的發(fā)現(xiàn)（1981）"fortheirdiscoveryofcatalyticpropertiesofRNARibozyme"SidneyAltman

ThomasR.Cech21TheNobelPrizeinChemistry1993Mullis的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNAKaryB.Mullis

"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"221997，TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine朊蛋白的發(fā)現(xiàn)

"forhisdiscoveryofPrions–anewbiologicalprincipleofinfection"StanleyB.Prusiner23Section2.

本章背景DNA單鏈的結(jié)構(gòu)24DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋化學(xué)結(jié)構(gòu)25Watson-Crickmodel：26為什么會(huì)想到Purine和Pyrimidine的配對(duì)？RosalindFranklin的結(jié)晶數(shù)據(jù)，3.4nm的距離如何解釋Chargaff’s規(guī)則27Section3.

基于DNA的DNA復(fù)制28DNA復(fù)制的一般特征：半保留復(fù)制以原先DNA作為模版，需要4種dNTP，Mg2+作為模板的DNA需要解旋需要引物復(fù)制方向始終是5’-3’具有固定的復(fù)制起點(diǎn)多數(shù)為雙向復(fù)制，少數(shù)為單向半不連續(xù)性高度的忠實(shí)性29DNA的復(fù)制方式：全保留復(fù)制Conservativemodel半保留復(fù)制Semiconservativemodel彌散復(fù)制Dispersivemodel30半保留復(fù)制證明實(shí)驗(yàn)1958

Meselson和Stanl實(shí)驗(yàn)----原核生物Taylor植物根尖細(xì)胞染色體放射性實(shí)驗(yàn)----真核生物3132DNA復(fù)制的起始：DNA的類型線性超螺旋環(huán)狀超螺旋環(huán)狀負(fù)超螺旋33原核生物的DNA復(fù)制環(huán)狀DNA一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)34真核生物的DNA復(fù)制線狀DNA多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)35拓?fù)洚悩?gòu)酶Topoisomerase復(fù)制起始位點(diǎn)（Ori）Originsofreplication復(fù)制叉Replicationfork解旋酶Helicases單鏈結(jié)合蛋白（SSB）Single-strandbindingproteins引物

Primer引發(fā)酶Primase36DNA聚合酶DNApolymerase

模板鏈

Template

strand37先導(dǎo)鏈

Leading

strand

后隨鏈

Lagging

strand5’3’3’5’38395’3’3’5’岡崎片段

Okazakifragment

4041DNA聚合酶IIIDNApolymerase

IIIDNA聚合酶IDNApolymerase

IDNA連接酶DNAligase

42問(wèn)題：為什么是5’-3’方向合成？為什么要用RNA作為起始模板？如何保證復(fù)制的忠實(shí)性？

43拓?fù)洚悩?gòu)酶

Topoisomerase拓?fù)洚悩?gòu)酶I自然狀態(tài)下DNA為負(fù)超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶I用來(lái)移除負(fù)超螺旋（熱力學(xué)過(guò)程）拓?fù)洚悩?gòu)酶II用來(lái)增加負(fù)超螺旋（消耗ATP）過(guò)程都是a.剪斷DNA鏈b.重新纏繞c.封口不同：I.不需ATP，剪斷單鏈II.需要ATP，剪斷雙鏈相同：活性中心為Tyr44拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用機(jī)理4546細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶II作為抗生素的靶點(diǎn)人拓?fù)洚悩?gòu)酶I作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)Camptothecin47DNA解旋酶

DNA

HelicasesDNA解旋酶需要ATP

48DNA聚合酶

DNApolymerase

ReplicationComparison

Procaryotic Eucaryoticspeed 1000b/sec 50b/secOkazaki 1000b 100-200b primer ~30b ~3-5borisites single multiplePol nuclease nonuclease49DNAPolymeraseIDNAPolIwasthefirstpolymeraseisolated.ThiswasobtainedfromE.colibyArthurKornbergandisknownastheKornbergenzyme.Thisenzymehasa5'-3'exonucleaseactivitythatcleavesRNAprimers,a5'-3'polymeraseactivitythatmakesDNAanda3'-5'exonucleaseactivitythatrepairsDNA.TheKlenowfragmentisthelargeportionaftercleavingoffthe5'-3'exonucleaseandhasbeenusedasapolymeraseinlabwork.50Klenow片段Klenowfragment又名DNA聚合酶I大片段漢斯·克列諾于1970年用枯草桿菌蛋白酶（subtilisin）處理大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ時(shí)，得到的兩個(gè)片段中分子量較大的一個(gè)。C末端605個(gè)氨基酸殘基片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3ˊ-末端的標(biāo)記粘性末端的單鏈補(bǔ)齊成為平頭51DNAPolymerase

Activity

兩個(gè)鎂離子綁定在活性中心52分子形狀vs氫鍵BothofthesedirectthymineintoaDNAstrandeventhoughtheonecannotformH-bonds.53構(gòu)象的變化WhenthecorrectdNTPbindsachangeoccursresultinginatightfitfortheproperdNTPshape.5455ProteinsInvolvedinDNAReplicationinE.coli56復(fù)制起始位點(diǎn)（Ori）

Originsofreplication大腸桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)命名為OriC245bp的高度保守序列在5’端有3個(gè)富含AT的序列（2個(gè)氫鍵1bp）在右邊有5個(gè)9bp的序列，用來(lái)綁定DnaA（起始因子）57例子：大腸桿菌的DNA復(fù)制DnaA消耗ATP綁定在9bp的序列，誘導(dǎo)打開(kāi)AT富集區(qū)域HU蛋白（組蛋白類似物）防止DnaA綁定OriC以外的序列當(dāng)loop被DnaB（解旋酶）打開(kāi)，在DnaT輔助下在復(fù)制叉處形成DnaB6?DnaC6?ATP6DnaB繼續(xù)解旋，增大解旋的空間，SSB結(jié)合到ssDNA上防止退火（Annealing）拓?fù)洚悩?gòu)酶II在復(fù)制叉的上方作用，用來(lái)減輕下方DnaB解旋的壓力PrimingEventsPriA,PriBandPriCenterthebubblealongwithDnaG(DNAprimase).ThiscompletestheprimosomewhichmakesRNAprimers.TopoIIandSSBarenotpartoftheprimosome.DNAprimasedoesnotneedaprimertobeginsynthesisofRNAprimers.Theprimers(10-30bp)beginatthecenterbaseofanyGTTsequenceandstartaprimeraboutevery1000bp.Onlyoneprimerisneededontheleadingstrand.Afterthisismade,theprimosomemovestothelaggingstrand.58ReplicationEventsTwoPolIIIholoenzymes(DnaE)enterwithafewotherproteinstocompletethereplisome.PolIIIisanasymmetricdimerthatsynthesizesDNAfrombothtemplatestrandssimultaneously.PolIIIneedsaprimertobeginsynthesis.Theleadingstrandissynthesizedcontinuouslyandthelaggingstranddiscontinously.Botharesynthesizedinthe5'-3'direction.Bidirectionalsynthesisoccursatbothreplicationforks.59DNAPolIII,theReplicasePolIIIformsaslidingclamparounddsDNA.Thisenzymeistheworkhorseofreplicationandisveryprocessive.60PrimingDNASynthesisAprimerisrequiretostartDNAsynthesis.61LeadingandLaggingStrandSynthesisOkazakifragmentsaremadeonthelaggingstrand.62LayoutofParticipantsGeneralarrangementofreplicationparticipants.6364SynthesisonbothStrandsPOLIIIformsaslidingclamparounddsDNA.Thisenzymeisveryprocessive.65LaggingStrandSynthesisThelaggingstrandloopstoenablebothPolIIIcoreunitstomoveinthedirectionofthereplicationfork.ThelaggingstrandbeginsreplicationataprimerandproceedsuntilitrunsintoanotherOkazakifragment.Atthispointthecoreunitdissociates,thechainshiftstopositionanotherprimer,thecorerebindsandmakesanotherOkazakipiece.Thelaggingstrandwillalwaysbealittlebehindtheleadingstrand.66JoiningOkazakiFragmentsJoiningthesefragmentsrequiresDNAligaseafternicktranslationhasoccured.67StepsforJoiningOkazakiFragmentsDNAligasesealsthenicksusingNAD+forenergyafterPolIhasremovedRNA.SomeorganismsuseATPtoadenylatetheligase.E-lys+NAD+-->AMP-NHlys-E+NMP5'-p-DNA+AMP-NHlys-E-->AMP-5'P-DNA+E-lysAMP-5'P-DNA+3'OH-DNA-->DNA(sealed)+AMP68E.coliTerminationTheE.coli''terregion''isa~350kbpsequence180ofromOriC.Itcontainssevensequences,TerAtoTerG,whicharebindingsitesfor''tus'',terminatorutilizationsubstance.TheTersequencesare~20bplongandcontaintheconservedsequence5'-GTGTGTTGT-3'.Whentusisboundreplicationstopsbyblockingthehelicase.G F B C A D E 5'-----à------à-----------à-------à-------?------?------?-------3'

6970PositionsoforiCandter

inE.coliE.coliTerminationTheclockwisereplicationisstoppedatterB,C,ForGandcounterclockwisereplicationatterA,DorE.Theprocessiscompletewhensynthesisfromtheoppositedirectionreachesthestoppedstrand.Atthispoint,thetwonewDNAsareintertwinedandTopoIImediatesunravelingthesebycleavageandreassembly.7172線性末端DNA復(fù)制碰到的問(wèn)題真核細(xì)胞染色體末端端粒端粒真核細(xì)胞的染色體線性末端序列用來(lái)穩(wěn)定染色體。在人體內(nèi)是重復(fù)序列AGGGTT。通過(guò)端粒酶在染色體末端逐漸加上。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。端粒酶含有RNA的模板。73端粒的合成Telomere

SynthesisTelomerasehasanRNAtemplate.74端粒的合成Telomere

Synthesis7576DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性也叫高保真度（High-Fidelity）Fidelity=1:109四種dNTP的平衡（體內(nèi)核酸代謝的調(diào)節(jié)）DNA聚合酶的高度選擇性（Proofreading）DNA聚合酶的自我校對(duì)功能（Exonuclease）錯(cuò)配修復(fù)（下一節(jié)內(nèi)容）使用RNA作為引物只能從5’到3’77Section4.

DNA的損傷及修復(fù)DNA的損傷的原因細(xì)胞內(nèi)因素DNA復(fù)制的錯(cuò)誤DNA自身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定活性氧ROS環(huán)境因素紫外輻射離子輻射化學(xué)誘變劑（黃曲霉素，順鉑，烷基化試劑，化學(xué)武器）78DNA損傷的類型堿基的損傷及DNA鏈的損傷堿基的丟失或脫落堿基的轉(zhuǎn)換堿基的修飾堿基的交聯(lián)DNA鏈的斷裂DNA鏈間交聯(lián)DNA鏈與蛋白交聯(lián)7