肝脂酶活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

肝脂酶活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理肝脂酶（hepaticlipase，HL）是一種脂肪分解酶，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成，存在于肝臟竇周間隙內(nèi)皮細(xì)胞表面和竇周間隙腔面的肝細(xì)胞微絨毛表面，可水解各種脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL），使各種脂蛋白顆粒的大小和密度發(fā)生變化，當(dāng)血漿中的HL及其活性增高時(shí)，可導(dǎo)致血漿中低密度脂蛋白（LDL）水平升高，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。HL水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生α-萘酚，可與固藍(lán)B鹽形成紫紅色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與HL活性成正相關(guān)。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)（能測(cè)595nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、制冰機(jī)、離心機(jī)·去離子水、丙酮·研缽或勻漿器試劑準(zhǔn)備ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫，若有沉淀析出屬正常現(xiàn)象，室溫靜置至沉淀消失即可（期間請(qǐng)勿大力搖晃）。4℃保存。ReagentIV：臨用前配制；48T加入0.7mL去離子水，96T加入1.4mL去離子水，吹打至充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝避光可以保存2周，避免反復(fù)凍融。Standard：臨用前配制；加入1mL丙酮配制成10μmol/mL的α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用不完的試劑-20℃避光可以保存2周。注意：ReagentII有毒，Standard有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)品制備：吸取30μL10μmol/mL的α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液于EP管中，向其中加入930μLReagentI配制成0.3125μmol/mL的α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)品，現(xiàn)用現(xiàn)配。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。測(cè)定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLReagentI，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定。若溶液有渾濁則離心后取上清進(jìn)行測(cè)定。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到595nm?？梢?jiàn)分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。將ReagentIII在30℃預(yù)熱20min以上。操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中進(jìn)行）：試劑測(cè)定孔（μL）對(duì)照孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）空白孔（μL）樣本上清202000標(biāo)準(zhǔn)品00200ReagentI809080100ReagentII1001010混勻，30℃反應(yīng)10min無(wú)需反應(yīng)，直接加入以下試劑ReagentIII80808080ReagentIV10101010充分混勻，30℃靜置5min后，于595nm處測(cè)定吸光值，分別記為A測(cè)定、A對(duì)照、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照、ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：每個(gè)測(cè)定管孔設(shè)一個(gè)對(duì)照孔，標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白孔只用測(cè)1-2次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測(cè)定小于0.05可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測(cè)定大于0.7，樣本可用去ReagentI進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。HL活力的計(jì)算：（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：每mg蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。HL(U/mgprot)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣÷(Cpr×V樣)÷T×F=0.03125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F（2）按樣本鮮重計(jì)算：酶活單位定義：每g組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。HL(U/g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T×F=0.03125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F（3）按樣本體積計(jì)算：酶活單位定義：每mL血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。HL(U/mL)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣÷V樣÷T×F=0.03125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×FC標(biāo)準(zhǔn)：α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.3125μmol/mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入ReagentI總體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；W：樣品質(zhì)量，g；F：樣本稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)ReagentIII出現(xiàn)氣泡可靜置，待氣泡消失，加樣時(shí)不要吸到氣泡。ReagentIV可能會(huì)析出少量沉淀，吹打使其充分溶解。若樣本為動(dòng)物肝臟，建議將樣本用ReagentI稀釋25倍以上再進(jìn)行檢測(cè)，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。若樣本為肥胖型動(dòng)物血清或血漿，建議將樣本用ReagentI稀釋5倍以上再進(jìn)行檢測(cè)，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。結(jié)果展示。Figure1.本試劑盒