總巰基測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

總巰基測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理生物體內(nèi)巰基主要包括谷胱甘肽巰基和蛋白質(zhì)巰基。前者不僅能夠修復(fù)氧化損傷的蛋白質(zhì)，而且參與活性氧清除，后者對(duì)于維持蛋白質(zhì)構(gòu)象具有重要作用。通過測(cè)定總巰基含量和谷胱甘肽含量，能夠間接測(cè)定蛋白質(zhì)巰基含量。巰基基團(tuán)與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測(cè)412nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、制冰機(jī)、離心機(jī)·去離子水、無水乙醇·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：臨用前配制；48T加入0.8mL無水乙醇，96T加入1.6mL無水乙醇充分溶解備用。4℃避光可以保存一個(gè)月。注意：ReagentII有毒，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Standard：臨用前配制；加入1.3mL去離子水配制成25μmol/mL的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品備用，4℃避光可保存2周。標(biāo)準(zhǔn)品制備：使用25μmol/mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)液，按照下表所示，進(jìn)一步稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品：序號(hào)Standard體積去離子水體積（μL）濃度（μmol/mL）Std.120μL25μmol/mLStandard9800.5Std.2500μLofStd.1(0.5μmol/mL)5000.25Std.3500μLofStd.2(0.25μmol/mL)5000.125Std.4500μLofStd.3(0.125μmol/mL)5000.063Std.5500μLofStd.4(0.063μmol/mL)5000.031Std.6500μLofStd.5(0.031μmol/mL)5000.016Std.7500μLofStd.6(0.016μmol/mL)5000.008Blank05000注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。測(cè)定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL去離子水，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定。若溶液有渾濁則離心后取上清進(jìn)行測(cè)定。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到412nm?？梢姺止夤舛扔?jì)用去離子水調(diào)零。酶促反應(yīng)（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中進(jìn)行）：試劑測(cè)定孔（μL）對(duì)照孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）空白孔（μL）樣本上清404000Standard00400ReagentI150150150150ReagentII100100無水乙醇010050混勻，25℃靜置10min后，于412nm處測(cè)定吸光值，分別記為A測(cè)定、A對(duì)照、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照、ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：每個(gè)測(cè)定孔需設(shè)一個(gè)對(duì)照孔，標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白孔只用測(cè)1-2次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測(cè)定小于0.01可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測(cè)定大于0.8，樣本可用去離子水進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程，將ΔA測(cè)定帶入方程得到x(μmol/mL)。2.總巰基含量的計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算：總巰基含量(μmol/mgprot)=x×V樣總÷Cpr=x÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：總巰基含量(μmol/g鮮重)=x×V樣總÷W=x÷W按樣本體積計(jì)算：總巰基含量(μmol/mL)=xV樣總：加入去離子水體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。結(jié)果展示Figure1.本試劑盒測(cè)定小鼠肝臟和小鼠肌肉中總巰基的含量相關(guān)