KTB1342-CN-糖原磷酸化酶a（GPa）活性檢測試劑盒（微量法）

糖原磷酸化酶a（GPa）活性檢測試劑盒（微量法）原理糖原磷酸化酶是糖原分解代謝中的關(guān)鍵酶，催化糖原的磷酸化反應。該酶分為有活性的糖原磷酸化酶a（Glycogenphosphorylasea,GPa）和無活性的糖原磷酸化酶b（Glycogenphosphorylaseb,GPb）兩種形式。糖原的分解主要在GPa的催化下進行。CheKine?糖原磷酸化酶a（GPa）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動物組織、細胞或細菌、血清（漿）或其他液體樣本。在該試劑盒中，未添加激活劑時，GPa催化糖原和無機磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NADP還原生成NADPH，在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映GPa活性。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ9.6mL19.2mL4℃，避光保存ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預期差異較大的樣本進行預實驗。自備耗材·酶標儀或紫外光分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingReagent：臨用前配制；將ReagentII全部轉(zhuǎn)移至ReagentI中，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復凍融。WorkingReagentIII：臨用前配制；48T加入0.6mL去離子水，96T加入1.2mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復凍融。WorkingReagentIV：臨用前配制；48T加入0.6mL去離子水，96T加入1.2mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復凍融。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。動物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細菌和細胞：收集500萬細菌或細胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細菌或細胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細菌或細胞30次（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。注意：1.如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1343的測定。實驗步驟酶標儀或紫外光分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，紫外光分光光度計用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：試劑測定孔（μL）樣本10WorkingReagentIII10WorkingReagentIV10去離子水10WorkingReagent160充分混勻，記錄340nm處10s時吸光值A1，37℃反應10min記錄610s時的吸光值A2。計算ΔA=A2-A1。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA大于0.6，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。若ΔA出現(xiàn)負值，則說明樣本中不含GPa或已降解。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖н^程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。GPa活性的計算使用96孔UV板測定的計算公式如下按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：每克樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W按細菌或細胞數(shù)量計算酶活單位定義：每104細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa(U/104)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(n×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷n按樣本體積計算酶活單位定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa(U/mL)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總)÷T=643×ΔAV反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；n：細菌或細胞數(shù)量，以萬計。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中光徑d：0.5cm調(diào)整為d：1cm進行計算即可。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定兔肝臟和心臟中GPa的活性。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB3030CheKine?乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測