軟骨魚類物種鑒定技術(shù)規(guī)范

1軟骨魚類物種鑒定技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了軟骨魚物種的形態(tài)學(xué)和基因條形碼鑒定技術(shù)，及其制品的軟骨魚成分下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，住日期的引用文GB/T6682分析實驗室GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測GB/T35918動物制品中動物源性檢測基因條碼技術(shù)Sanger測序法LY/T2501野生動物及其產(chǎn)品的物種鑒定規(guī)范內(nèi)骨骼為軟骨的魚類，包括全頭亞綱和板鰓亞綱。體被盾鱗，想裂4對~7對，多直接開口于體表。鰓蓋，后具一總鰓孔。背鰭硬棘能豎垂。雄性除具緒腳外，還具1對腹前鰭腳和1個額鰭腳。尾歪形、軟骨魚綱中的亞綱。體長形，披盾鱗。鰓隔發(fā)達(dá)呈板狀。鰓裂5對一7對，各自單獨開口于身體表2DNA條形碼DNAbarcode終止核苷酸為止。每個反應(yīng)合有四種dNTP,并混入用熒光標(biāo)記的ddNTP.使廷長的寡聚核苷酸選擇BOLD:生物條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(BarcodingofLifeDataSystem)目標(biāo)基因CACGACGTTGTAAAACGACTCAACYAATCAYAAAGATATYGGATAACAATTTCACACAGGACTTCYGGGTGRCCRAARA 47實驗室基本要求和防污染措施鑒定過程中實驗室的基本要求和防止交又污染的措施按照LY/T2501、GB/T27403中的規(guī)定8.3形態(tài)學(xué)方法中具有唯一性的特征指標(biāo)可以單獨使用，如指標(biāo)特征不具有唯一性，聯(lián)合使用2個以9.1測量和觀察下列(但不限于)各形態(tài)特征指59.2依據(jù)軟骨魚的形態(tài)特征和軟骨魚分類檢索表(軟骨魚中涉及瀕危物種的種類分類指標(biāo)特征見附換新的干凈工具。每個樣本取樣后應(yīng)裝于無菌容器并做好標(biāo)記，避免樣本間交叉污染。如不能立即進(jìn)行核酸提取，組織樣本應(yīng)置于-20℃冷凍保存或于陰涼處保存在新配制的95%乙醇中，需長期保存的樣本應(yīng)儲存在-80℃.離心15min。棄上清，用1mL0.m3/LTris-HCI溶液洗滌樣品3次，振蕩混勻，10000r/min離心取處理后樣品約200mg置于潔凈1.5mL離心管中，加入600μL裂解液和20pμL蛋白酶K溶液，混勻，于65℃溫浴30min(樣品難以裂解時可以適當(dāng)延長裂解時間),期間不時輕微振動混勻。冷卻至室溫，加入600μL三氯甲烷：異戊醇(24:1),充分混勻，12000r/mn離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的1.5mL離心管中。加4℃預(yù)冷的0.8體積的異丙醇，輕柔顛碼混合，-20℃放置10min,4℃12000r/min離心10min。棄上清，加600μL4℃預(yù)冷的70%乙碎，輕輕混勻，于4℃,12000r/min離心10min。棄上清，晾干；干燥后加入50μL去離子水或TE緩沖液溶解。DNA提取液應(yīng)置于冰上備用，若需長期保存應(yīng)置于-20℃保存。滿足試驗條件下，也可采用經(jīng)驗證后等效的商品化DNA抽提試劑盒提取樣品DNA,并按試劑盒L0XPCRBuffer(含Mg+)FISHCOIL.BC_is(10umo高保真DNA聚合酶(5U/μL)℃4IK——尾培長L-M口長：—體高：cB—外鼻孔E—鰭腳：7—人水孔3a.尾鰭長，近全長之半。最后2鰓孔在胸鰭缸上方…………長尾監(jiān)科(Alopidae)3b.尾鰭較短。鰓孔均位于胸鰭基的前方，部孔大恒不延伸至頭背方…………鼠鯊科(Lamnidae)5a.上頜齒寬扇，三角形，具鋸齒…………………5b.上領(lǐng)齒狹長，錐形，邊緣光滑：前頜最前2齒與其它齒同形。尾柄兩側(cè)各有7a.背部深灰色，腹部白色，無斑點：第一背鰭15a,上下頜齒或至少上頜齒邊緣具細(xì)鋸齒，基底上小齒頭或有或無………………真監(jiān)屬(Carcharhimws)16a.第1背鰭上角和胸鰭外角均寬圓；臀鰭后端幾乎達(dá)尾鰭起點………………長鰭真鯊(Carcharhinuslongimanus)4b.頭顱額區(qū)向左右兩側(cè)突出，眼位于突出的兩端……18a.吻端中央圓凸…………………………錘頭雙智鯊(Sphyrnazygaena)18b.吻端中間凹入；里鼻溝顯著;臀鰭基底長大于第2背鰭基底長………路氏雙髻鯊(Sphyrnaleuin)18e.吻端中間凹人；里鼻溝消失，臀鰭基底約與第2背鰭基底等長…………………無溝雙馨鯊(Sphyrnamokarran)26a.體背黑色，具不規(guī)則棕褐色斑塊，且具一對彎曲黑27a.尾細(xì)長如鞭，尾縮上下葉退化…………28a.尾長約為體盤長的3倍，體背黃褐色；僅尾下方具皮膜：口底具乳29b.口綠位于頭略后方；頭窄…………………(規(guī)范性)HCI調(diào)pH至7.5,加去離子水至定容1L,121℃滅菌15min后使用。C.20.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)EDTANaOH調(diào)pH至8.0.加去離子水至定容1L.121℃滅菌15mm后使用。NaClCTAB1mol/LTris-HCI(0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)HCI或NaOH調(diào)pH至8.0,加去籬子水至定容1L,121℃滅菌15min后使用。0.5mol/LEDTK溶酒(pH8.0)HCI或NaOH叫H至8,0.加去離子水至定容1L,121℃滅菌15min后使用。C.5TAE電泳緩沖液用NaOH詞pH至8.3,加去離子水至定容1L.加去離子水至定容1L。將200mg的蛋白酶K加入9.5mL水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。加水定容到10mL,然后分裝成小份儲存于-20℃?zhèn)溆?。用去離子水配制成10mg/mL的濃縮液，使用時每100mL瓊脂糖凝膠中加5pL。[1]SaraM.Handy,JonathanR.Deeds,NataliaV.Ivanova,etaL.FDAStandardure(SOP)forGeneratingDNABarcodesSuita