飼料中反芻動(dòng)物、禽及魚源性成分液相芯片檢測(cè)方法

飼料中反芻動(dòng)物、禽及魚源性成分液相芯片檢測(cè)方法2MES:2-(N-嗎啡基)乙磺酸[2-(N-Morpholino)cthanMFI:熒光強(qiáng)度中位值(Medianfluoresenceintensity)PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電泳(PolyacrylamidePCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymerasechaiSAPE:鏈霉親和素棗紅蛋白(Streptavidin-phycoTag:水生棲熱菌(Thermusaquatic)TMAC:氯化四甲基胺(Tetramethylammoniumchloride)液相芯片技術(shù)以直徑約6pm的微球?yàn)榛|(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。微球懸浮于液相體系中，構(gòu)成液相芯基因進(jìn)行檢測(cè)。每種微球都有一個(gè)獨(dú)特的熒光編碼號(hào)，每種編碼微球表面通過偶聯(lián)反應(yīng)固定一種特異基團(tuán)；使雜交產(chǎn)物與SAPE進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生報(bào)告熒光，隨后利用液相芯片檢測(cè)儀對(duì)微球進(jìn)行熒光編基因組中的COI基因、魚線粒體基因組中的12SrRNA保守區(qū)為靶標(biāo)，采用反芻動(dòng)物通用引物和魚通用引物和探針，進(jìn)行反芻動(dòng)物、禽及角共3大類動(dòng)物源5.3臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：離心速度不低于42000r/min.5.11搖床。5.14可調(diào)微量移液器及帶濾芯吸頭：0.5μL~10pL、10μL~100μL、20μL~200pL、20035.15微量離心管：1.5mL。5.16PCR反應(yīng)管。6.1除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。試驗(yàn)用水符合GB/T6682中二級(jí)水的要求。6.2微球：采用酸基化非磁性微球(MicroPlexbeads),或酸基化磁性微球(MagPlexbeads)。6.3擴(kuò)增引物和探針。各條下游引物的5'端均標(biāo)記生物素(biotin),HPLC純化；各條探針的5'端均C12標(biāo)記氨基(AmM),HPLC純化；上游引物采用PAGE純化。反芻動(dòng)物、禽和魚源性成分特異擴(kuò)增引物和探針序列見表1。采用無核酸酶超純水將每條引物配制成100gmol/L儲(chǔ)存液，置-20℃以下凍存，使用時(shí)，根據(jù)表2,取適量配制成5μmol/L或10gmol/L工作液，避免多次凍融。用無核酸酶超純水將每條探針配制成100μmol/L溶液，直接使用，剩余探針液置-20℃以下陳存，避免多次凍融。表1擴(kuò)增引物與探針序列6.4熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶?？刹捎肞romegaGoTagHotStartPolymerase"或其他等效產(chǎn)品。6.5無核酸酶超純水。6.6無水乙醇。6.7MES溶液：配制方法按附錄A中A.1。6.8TMAC溶液：1.5×TMAC配制方法按A.2,1×TMAC配制方法按A.3。6.9EDC溶液：配制方法按A.4。6.100.02%Tween-20:配制方法按A.5。6.110.1%SDS:配制方法按A.6。6.12TE緩沖液：配制方法按A.7。5DNA溶液，用無核酸酶超純水稀釋至1mL,分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值，按照公式(1)計(jì)算DNA濃度。當(dāng)OD/ODm比值在1.7~2.1之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。A——260nm處的吸光值；7.3.2.1取出MagPlex微球原液(濃度：1.25×10//mL)儲(chǔ)存管，恢復(fù)至室溫。渦旋振(100gmol/L)及5pL用無核酸酶超純水新鮮配制的EDC熔液(10mg/mL),7.3.2.4取出，再次加人5pL重新配制的EDC溶液(10mg/mL),渦旋振蕩混勻，重復(fù)上述條件孵育7.3.2.8渦旋振蕩1m炸超聲20s,取8pL.偶聯(lián)微球懸液，用TE緩沖液(pH8,0)稀釋10倍，取7.3.2.9將偶聯(lián)微球液置4避光保存。分混勻，取20pL.非磁性微球原液到已盛有600μLMES簾液(0,1mol/L,pH4.5)的微量離心管中。7.3.3.2置臺(tái)式高速離心機(jī)，12000r/min離心10min,同時(shí)用無核酸酶超純水配制EDC溶液7.3.3.5取出，再次加人5gL重新配7.3,3.6加入1mL0.02%Tween-20,渦旋振蕩混勻，12000r/min離心5min,吸棄上清。7.3.3.7加入1mL.0.1%SDS,渦旋振蕩混勻，12000r/min離心10min,吸棄上清。67.3.3.9渦旋振蕩1min并超聲20s,取8μL偶聯(lián)微球懸液，用TE緩沖液(pH8.0)稀釋10倍，取7.3.3.10將偶聯(lián)微球液置4℃避光保存。每種各0.2mmol/L),4mmol/LMgCl?,20mmol/L的Tris-HCI(pH8.0),1500.5mg/mL的牛血清白蛋白和3%的甘油，引物(按表2),熱啟動(dòng)TagDNA聚合酵1U,DNA模板7.4.2.1按照表2配制三重不對(duì)稱擴(kuò)增反應(yīng)液。根據(jù)待檢樣品數(shù)和對(duì)照數(shù)量，配制預(yù)混擴(kuò)增反應(yīng)液。需配制的預(yù)混擴(kuò)增反應(yīng)液數(shù)量=待檢樣品數(shù)+對(duì)照個(gè)數(shù)+1。按照上述反應(yīng)體系，將各組分試劑按計(jì)算時(shí)，采用單靶標(biāo)或二重靶標(biāo)對(duì)應(yīng)特異引物，在表2所列各試劑組分中，用無核酸酶超純水替代未采用和陽性對(duì)照核酸各1mL,混勻，蓋上管蓋。將已完成加樣的PCR反應(yīng)管放入PCR儀，啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置：95℃29(規(guī)范性)容至250mL,室溫儲(chǔ)存。1mol/L.Tris-HCI(pH8.0)配制：稱取121.1gTris堿解，加入約42mL濃HCI,應(yīng)使溶液冷至室溫后0.5mol/LEDTA(pH8.0)配制：稱取1溶解，用NaOH調(diào)pH至8.0(約需20g),定容至1L,滅菌后分裝；室溫儲(chǔ)存。1.5×TMAC配制：量取商品化5mol/LTMAC溶液225mL,20%N-月桂酰肌氨酸鈉1.88mL,1mol/L量取5mol/LTMAC150ml.20%N-月桂酰肌氨酸鈉1.25mL,1mol/L.Tris-HCI(pH8.0)裝.4℃儲(chǔ)存。A.4EDC溶液事先精確稱量及分裝EDC,按10mg/管分裝至深色避光離心管中，置-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)A.7TE緩沖液(pH8.0)分別量取5mL1mol/L