核酸擴(kuò)增技術(shù)分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室課件

分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握：PCR技術(shù)的基本原理及反應(yīng)體系；及PCR產(chǎn)物電泳檢測方法。熟悉：PCR常見問題及體系優(yōu)化；實(shí)時(shí)熒光定量RCR的原理。了解：PCR衍生技術(shù)；產(chǎn)物的其他檢測方法；PCR方法標(biāo)準(zhǔn)化。目錄聚合酶鏈反應(yīng)01PCR衍生技術(shù)02CONTENTS分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)CONTENTSPCR檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用03PCR衍生技術(shù)PART02一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，結(jié)合相應(yīng)軟件，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR靈敏度高只能進(jìn)行半定量定性分析高精確度不安全易污染安全省時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)、熒光、定量指在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，PCR產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。如何實(shí)時(shí)檢測？？？實(shí)時(shí)、熒光、定量參照已知拷貝數(shù)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)，通過擴(kuò)增及對(duì)熒光值的監(jiān)測，對(duì)待測DNA起始模板量的定量。如何定量？？？一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本概念擴(kuò)增曲線1基線2熒光閾值3Ct值4基本概念在引物、模板、緩沖液、酶等都充足的理想狀態(tài)下，熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線應(yīng)該是這樣的：基本概念在dNTP和酶都有限的情況下，擴(kuò)增曲線如下圖所示，有一個(gè)平臺(tái)期，酶逐漸失活，dNTP消耗殆盡，產(chǎn)物增加量逐漸減少；直至沒有任何產(chǎn)物生成，數(shù)目保持恒定。擴(kuò)增曲線橫坐標(biāo)縱坐標(biāo)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)，進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集。Q-PCR分四個(gè)階段擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜線性圖譜基線基線平臺(tái)期熒光背景信號(hào)階段終產(chǎn)物與起始模板量之間沒有線性關(guān)系。擴(kuò)增的信號(hào)被背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。一般把擴(kuò)增PCR前15個(gè)循環(huán)信號(hào)為本底信號(hào)（基線期）。熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量呈線性關(guān)系。熒光閾值/fluorescencethreshold在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值（即一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)），它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。熒光閾值/fluorescencethreshold閾值Ct值/CyclethresholdPCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物（熒光信號(hào)）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值的意義Ct值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同時(shí)進(jìn)行96次擴(kuò)增Ct值與濃度不同的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的Ct值不同Ct值和初始模板有什么關(guān)系？每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線104105106103102起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品熒光閾值熒光信號(hào)強(qiáng)度循環(huán)數(shù)未知濃度樣品10202530不同的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的Ct值不同標(biāo)準(zhǔn)曲線初始DNA量（log/p>

5432Ct值利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線通過未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光染料摻入的原理？---熒光強(qiáng)度與模板數(shù)量成正比熒光探針：SYBRGreen1熒光染料常用的有綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM及其它熒光報(bào)告基團(tuán)。TaqManMolecularBeacons（一）熒光探針技術(shù)探針的5′端和3′端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)R和熒光淬滅基團(tuán)Q。探針完整時(shí)R基團(tuán)與Q基團(tuán)分別位于探針的二端，Q基團(tuán)抑制R基團(tuán)使其不能發(fā)射熒光。熒光素標(biāo)記探針（一）熒光探針技術(shù)（一）熒光探針技術(shù)（二）SYBR熒光染料PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreenⅠ染料，能選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNA分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。PCR過程中，SYBRGreenI染料結(jié)合到新合成的雙鏈DNA分子中，結(jié)合的熒光信號(hào)和DNA含量成正比。（二）SYBR熒光染料SYBRGreen1SYBRGreen1結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA