肺癌分子病理診斷進(jìn)展

非小細(xì)胞肺癌分子病理檢測引言

肺癌仍是最常見惡性腫瘤；肺惡性腫瘤95％NSCLC(75-80%)VS

小細(xì)胞癌鱗癌（44/25％），腺癌（28/42％），小細(xì)胞癌20/13％，大細(xì)胞癌9/2%影像診斷技術(shù)的進(jìn)步：癌前病變、早期肺癌病例明顯增多臨床治療對診斷要求提高，推動(dòng)了病理的進(jìn)展診斷技術(shù)差異VS病因改變？一、肺癌病理分類：分子病理類型小細(xì)胞癌（%）腺癌（%）鱗癌（%）突變BRAF0<50EGFR高加索人群

亞洲人群<1<510-2035-45<1<5ERBB2/HER20<50KRAS高加索人群

亞洲人群<1<115-355-10<5<5PIK3CA<5<55-15RB>905-155-15TP53>9030-4050-80擴(kuò)增EGFR<15-1010ERBB2/HER2<1<5<1MET<1<5<5MYC20-305-105-10FGFR1<1<515-25基因重排ALK05<1RET01-20ROS101-20NTRK10<10NRG10<10肺癌中的主要基因改變（2015WHO分類）國際各大指南（CAP/IASLC/AMP、NCCN、ATLAS、ESMO指南）均給予晚期NSCLC分子病理診斷與組織病理同等重要的地位含腺癌成分必須檢測EGFR&ALK鱗癌小標(biāo)本推薦檢測EGFR&ALK（東）亞洲血統(tǒng)女性不吸煙者腺癌伴貼壁生長特征、乳頭型、微乳頭型TTF-1陽性往往伴有EGFR突變起源于II型肺泡上皮細(xì)胞、Clara細(xì)胞、非纖毛支氣管上皮EGFR突變肺腺癌Curvesforexon21usingtheARMSmethod.Curvesforexon19usingtheARMSmethod15–basepairdeletionatexon19K-ras突變肺腺癌西方（高加索人-30%）吸煙者,東亞病人:-10%;浸潤性黏液腺癌（黏液型BAC）、肺癌伴杯狀細(xì)胞特征、實(shí)體型腺癌；與EGFR突變、EML4-ALK相互排他；EGFR-TKIs抵抗。（東）亞洲血統(tǒng)年輕病人不/輕度吸煙者腺癌伴印戒細(xì)胞特征最多見、實(shí)體型較常見，各種類型均有報(bào)道與EGFR突變、K-RAS相互排他起源：比EGFR突變肺癌更大、更近端的細(xì)支氣管。EML4-ALK肺腺癌ALK陽性NSCLC具有鮮明的臨床及病理特征特征EGFR突變EML4/ALK組織學(xué)腺癌TTF1+腺癌TTF1+亞型非粘液型粘液型吸煙狀態(tài)不吸煙不吸煙人種東亞所有人種發(fā)病年齡66歲52歲性別女性無差異ShawAT,etal.JClin

Oncol2009;27:4247-4253.ALK陽性NSCLC年齡50歲左右偏年輕中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華結(jié)核呼吸科雜志2014年3月第27卷第3期ALK陽性非小細(xì)胞肺癌已成為NSCLC特定的亞型不同的驅(qū)動(dòng)基因不同的治療方法不同的臨床&病理特征AT.Shaw,etal.JClin

Oncol,2009不同的患者預(yù)后ALK陽性NSCLC定義ALK陽性非小細(xì)胞肺癌：是指包括ALKFISH檢測陽性、ALK序列融合變異或ALK融合蛋白表達(dá)陽性的肺癌，腫瘤細(xì)胞中存在ALK融合基因表達(dá)，是非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)分子亞型，常見于腺癌，該類患者通?？蓮腁LK抑制劑治療中獲益。張緒超等.中華病理學(xué)雜志2013;42(6):402-406.ALK陽性NSCLC的診斷-三大指南推薦適宜人群診斷方法中國EGFR與ALK陽性NSCLC診斷及治療指南（2014）所有含腺癌成分的NSCLCFISH,經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的IHC與RT-PCR，其余IHC可做為篩選CSCO中國專家共識所有含腺癌成分的NSCLC，富集人群可優(yōu)先檢測FISH,VentanaIHC,RT-PCR,常規(guī)IHC可做初篩晚期非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療專家共識所有含腺癌成分的NSCLCFISH,RT-PCR，VentanaIHC中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期中華結(jié)核呼吸雜志2014年3月第37卷第3期2015NCCNV1:小標(biāo)本的鱗癌也需檢測EGFR&ALKNSCLC活檢組織標(biāo)本陰性或未知；據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)§新鮮標(biāo)本VentanaIHC常規(guī)IHC檢測*

陽性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突變且使用EGFR-TKIs后出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)耐藥的患者石蠟標(biāo)本3+/2+/1+陰性ALK陽性非小細(xì)胞肺癌EGFR突變檢測中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期VentanaALK(D5F3)的CFDA注冊臨床實(shí)驗(yàn)

三家公立醫(yī)院超過1100例NSCLC樣本進(jìn)行VentanaALK(D5F3)與FISHALK結(jié)果的對比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VentanaALK(D5F3)與FISHALK的一致性為99.23%ParallelFISHandImmunohistochemicalStudiesofALKStatusin3244Non–Small-CellLungCancersRevealMajorDiscordancesLargestseriesthusfarofparallelFISHandIHCALKtestingin3244consecutiveNSCLCcasesanalyzedattwoindependentFrenchcenters.FISH-positiveand/orIHC-positiveresultsweredemonstratedin150of3244cases(4.6%).Strikingly,only80of150specimenswereclassifiedasALKpositivebybothtechniques.Thus,asingleFISHorIHCanalysisperformedalonewouldhavefailedtodetectapproximatelyone-fourthoftheALK-positivecasesJThorac

Oncol.2014;9:295–306VentanaIHC試劑盒已于2013.8全部獲得CFDA批準(zhǔn)，用于檢測ALK陽性NSCLCALK陽性NSCLC診斷方法比較FISH：昂貴的金標(biāo)準(zhǔn)PCR：結(jié)果詳細(xì)(ForALKonly)FISH(AbbottVysis)IHC(Ventana/RTD)IHC(手動(dòng)/CST)PCR（Amoy）SFDA批準(zhǔn)時(shí)間2014年10月28日2013年8月8日/2013年3月26日可檢測融合類型所有融合類型，但不能區(qū)分所有融合類型，但不能區(qū)分所有融合類型，但不能區(qū)分已知的多數(shù)融合類型操作要求高，需經(jīng)培訓(xùn)且有經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師判讀簡便簡便簡便所需組織量厚度3-5μm的石蠟切片，1張厚度3-5μm的石蠟切片，2張厚度3-5μm的石蠟切片，1張0.1-0.5μgRNA蠟塊4-5片胸水，新鮮組織優(yōu)點(diǎn)特異性高操作簡便、價(jià)格便宜、可直接診斷操作簡便、價(jià)格便宜、可篩選操作簡便、敏感性高價(jià)格高低低高Ventana：最具性價(jià)比的標(biāo)準(zhǔn)*依照規(guī)范化流程處理的FFPE樣本，其RNA質(zhì)量已完全滿足實(shí)時(shí)RT-PCR的檢測要求中華病理學(xué)雜志2013年6月第42卷第6期肺鱗癌分子靶點(diǎn)檢測FGFR1：FGFR酪氨酸激酶家族，有擴(kuò)增預(yù)后差，復(fù)發(fā)和死亡的顯著獨(dú)立預(yù)后影響因子；最有希望的針對性靶向藥物PI3KCA突變對抑制劑療效有預(yù)測價(jià)值EGFR擴(kuò)增和EGFRVIII突變：預(yù)后差，但TKI療效不相關(guān)大細(xì)胞癌（2015WHO）大細(xì)胞癌大細(xì)胞NE癌（歸入神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤）復(fù)合型（伴鱗癌/腺癌等，單獨(dú)分類）基底樣癌（歸入鱗癌）淋巴上皮樣癌（單獨(dú)分類）透明細(xì)胞癌（保留但不做為獨(dú)立亞型）大細(xì)胞癌伴橫紋肌樣表型（保留但不做為獨(dú)立亞型）免疫表型分型ModernPathology,2013,26:511-522102例TTF1+/△Np63-：LCC-ADC（LCC伴腺癌表型）TTF1-/△Np63+：LCC-SQCC（LCC伴鱗癌表型）TTF1-/△Np63-：LCC-null（LCC-無任何免疫表型）TTF1+/△Np63+LCC-AD-SQC（LCC伴腺癌和鱗癌表型）

不同免疫亞型大細(xì)胞癌的生存分析ModernPathology,2013,26:511-522生存期：LCC-AC＞LCC-SQCC＞LCC-null分子遺傳學(xué)改變

EGFRKRASALKBRAFMAP2K1/MEK1ModernPathology,2013,26:511-522不同免疫亞型大細(xì)胞癌的總體基因突變分布情況二、肺癌分子病理檢測技術(shù)腫瘤靶向治療中分子靶點(diǎn)檢測方法免疫組織化學(xué)（IHC）－蛋白表達(dá)熒光原位雜交(FISH)、SISH、CISH

－基因擴(kuò)增、融合/易位基因突變檢測（DNA測序、熒光實(shí)時(shí)定量PCR、焦硫酸測序、ARMS突變、SSCP、高效變性液相色譜、基因芯片……）－有無基因突變、突變類型及位置新方法敏感性高，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大樣本篩選最終結(jié)果仍需直接測序法驗(yàn)證。絕大部分實(shí)驗(yàn)室都已經(jīng)接受直接測序法是最可靠的評估方法，是判斷突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”SuggestedalgorithmformoleculartestingforpatientswithNSCLCAD基因突變檢測流程腫瘤標(biāo)本采集標(biāo)本處理及評估突變檢測患者臨床醫(yī)生胸外科醫(yī)師內(nèi)鏡醫(yī)師收集肺癌組織標(biāo)本病理科醫(yī)生準(zhǔn)備樣本實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)室人員報(bào)告結(jié)果給臨床醫(yī)生腫瘤科醫(yī)生放療科醫(yī)生呼吸科醫(yī)生胸外科醫(yī)師WHO2015肺癌病理分類重視活檢和細(xì)胞學(xué)分子病理診斷70％肺癌病理診斷（多為晚期病人）活檢和細(xì)胞學(xué)組織不僅僅用于常規(guī)診斷、免疫組化，還要進(jìn)行分子靶點(diǎn)的檢測NSCLC患者EGFR檢測送檢率低

全國2013年EGFR送檢率為20%，遠(yuǎn)低于歐洲以及日本，臺(tái)灣的送檢率，一方面，中心城市的送檢率還有待提高，另一方面，目前已有的70家檢測平臺(tái)，超過80%集中在省會(huì)城市，周邊城市因平臺(tái)缺乏導(dǎo)致了送檢率低2010AZ

JapanSurveyresult(N=587physicians)檢測標(biāo)本類型的選擇有待改進(jìn)日本檢測標(biāo)本的選擇中國檢測標(biāo)本的選擇

眾多晚期NSCLC病人無法獲取組織標(biāo)本，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本是一個(gè)很好的補(bǔ)充，但是細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可以用于檢測的觀念尚未被大范圍的認(rèn)可。致使許多病人失去檢測的機(jī)會(huì)。DataformAstraZenecaChinainternal腫瘤組織標(biāo)本

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本血液標(biāo)本尿液、唾液標(biāo)本

NSCLC驅(qū)動(dòng)基因檢測標(biāo)本類型高腫瘤含量胸水?dāng)y帶豐富的腫瘤信息胸水進(jìn)行肺腺癌組織學(xué)類型診斷在胸水中進(jìn)行ALK融合狀態(tài)檢測根據(jù)胸水檢測ALK蛋白表達(dá)與臨床治療關(guān)系No.aAgeSexIHC-ALKFISH-ALKResponseECOGPSTherapyMonths DiscontinuationofcrizotinibP547M++PD1First-line2YesP882M++CR1First-line10NoP966F+

SD1First-line3YesP1360F++PR1First-line13NoP1652M++PR0Second-line13NoP2045M+

SD1First-line16NoP2150M++SD1Third-line6NoP2251F++SD3First-line4NoP2421F++PR3First-line2NoP2648F++CR1First-line6NoP2731F++PR1First-line1No客觀緩解率（ORR）：54.5%(6/11)

疾病控制率（DCR）：90.9%(10/11)在病理診斷方面，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制作細(xì)胞學(xué)蠟塊后，通過免疫組化染色，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的病理診斷，可以成為組織學(xué)標(biāo)本良好的替代品；在病理質(zhì)控及采用正確前期處理方法的前提下，所有基因、且一種基因蛋白水平、DNA、RNA改變的分子檢測均可在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本上進(jìn)行，突變率與組織學(xué)檢查突變率相當(dāng)；療效隨訪結(jié)果證實(shí)，與根據(jù)組織學(xué)標(biāo)本所獲的療效一致。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本替代組織學(xué)標(biāo)本總結(jié)如何加快分子病理檢查報(bào)告速度？與臨床醫(yī)師溝通，及時(shí)進(jìn)行EGFR突變檢測；常規(guī)HE切片時(shí)，預(yù)留標(biāo)本石蠟卷備用。一旦HE觀察確認(rèn)為肺腺癌，同步進(jìn)行免疫組化和突變檢測；RealtiemPCR檢測速度快于DNA測序。各種商業(yè)化的生物公司、獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)科病理科誰來進(jìn)行腫瘤分子靶點(diǎn)檢測？肺癌分子靶向指標(biāo)檢測由于肺癌異質(zhì)性，取材方法不同，區(qū)域不同，標(biāo)本處理方法不同導(dǎo)致不同的結(jié)果肺癌病理分類：異質(zhì)性50%肺癌含二種或幾種組織類型！不同切片、不同視野癌的類型有所不同常見類型：腺癌/鱗癌；梭形細(xì)胞/多形性癌腺癌/鱗癌/小細(xì)胞癌病理質(zhì)量控制的流程組織處理、蠟塊和H&E染色切片制作病理質(zhì)量控制質(zhì)量達(dá)標(biāo)

基因突變檢測質(zhì)量不達(dá)標(biāo)終止基因突變檢測組織標(biāo)本接收

蠟塊未染色切片H&E染色切片去除標(biāo)記以外的區(qū)域MagerSR,etal.EurJCancer2007;43(5):828-834.病理科建立分子檢測平臺(tái)的三種模式：病理科分子病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測并與病理形態(tài)結(jié)合審核、簽發(fā)報(bào)告部分檢測項(xiàng)目外包大型的病理科實(shí)驗(yàn)室、規(guī)范的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室或商業(yè)實(shí)驗(yàn)室病理標(biāo)本處理后分子檢測外包獲得檢測數(shù)據(jù)后分析并與病理形態(tài)結(jié)合審核、簽發(fā)報(bào)告二、肺癌分子病理檢測技術(shù)：

二代測序高通量二代測序技術(shù)（NGS）相對于傳統(tǒng)的Sanger測序而言高通量測序以其高數(shù)據(jù)輸出量與高解析度的特性，同時(shí)檢測多個(gè)基因的突變，融合和拷貝數(shù)變化情況，而且使得檢測的費(fèi)用和時(shí)間大大縮短。二代測序的優(yōu)勢小細(xì)胞癌（%）腺癌（%）鱗癌（%）突變BRAF0<50EGFR高加索人群

亞洲人群<1<510-2035-45<1<5ERBB2/HER20<50KRAS高加索人群

亞洲人群<1<115-355-10<5<5PIK3CA<5<55-15RB>905-155-15TP53>9030-4050-80擴(kuò)增EGFR<15-1010ERBB2/HER2<1<5<1MET<1<5<5MYC20-305-105-10FGFR1<1<515-25基因重排ALK05<1RET01-20ROS101-20NTRK10<10NRG10<10肺癌中的主要基因改變（2015WHO分類）60Newmanetal.,NatMed(2014)覆蓋96%NSCLC病人平均4個(gè)突變/病人敏感性特異性StageI(n=4)50%96%StageII-IV(n=9)100%96%Allstage(n=13)85%96%(Formutantallelefractions>0.02%)血液EGFR基因突變檢測發(fā)展與展望：二代測序方法優(yōu)點(diǎn)：拓展了基因突變檢測的深度和廣度局限性：其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用需要更多的數(shù)據(jù)積累。非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測的中國專家共識NCCNVersion3.2014:moleculardiagnosis首次革命性推薦多重測序/二代測序用于診斷精準(zhǔn)診斷的陷阱精準(zhǔn)診斷的陷阱Driver基因突變

VSPassenger？體細(xì)胞突變≠驅(qū)動(dòng)基因突變驅(qū)動(dòng)基因突變≠藥物靶點(diǎn)基因同樣基因不同突變類型≠相同的藥物療效測序深度VS測序方法新測序技術(shù)將DNA切成更短的片段，短片斷重新組裝在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性，檢測基因組中擁有大塊重復(fù)序列的區(qū)域更加困難；海量數(shù)據(jù)的解讀？質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)？如何驗(yàn)證？目前無獲批的產(chǎn)品，魚目混珠！同一基因改變在不同腫瘤中的價(jià)值：不同的診斷、預(yù)后、治療價(jià)值NGS臨床檢測的現(xiàn)狀關(guān)于NGS檢測樣本的質(zhì)控還沒有明確的規(guī)范，數(shù)據(jù)的解析等一些列問題還沒有明確的規(guī)范國內(nèi)也沒有一款獲批的基于NGS的腫瘤生物標(biāo)志物檢測試劑盒NGS的收費(fèi)還比較高二、肺癌分子病理檢測技術(shù)：

液體活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)的組織靶基因檢測亦存局限

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

EGFRMu/WildEGFRMu/T790MEGFRMu/C-METEGFRMu/KRAS

重復(fù)活檢和

動(dòng)態(tài)檢測困難

部分患者無組織標(biāo)本

或無足夠的組織標(biāo)本

進(jìn)行基因分型Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2013分子標(biāo)志物血液檢測兩大研究方向血漿/血清游離DNA（cell-freeDNA，cfDNA）循環(huán)血腫瘤細(xì)胞（circulatingtumourcell，CTC）血液檢測在腫瘤治療中的應(yīng)用NatureReviews472-484Vol.10August2013Nature524Vol.511July2014外周血循環(huán)腫瘤DNA可用于血液基因突變檢測腫瘤患者血液中的游離DNA的含量比正常人高其遺傳學(xué)特性與腫瘤基因組DNA相似ctDNA已從不同癌種的ctDNA中檢測到多種基因變異血液EGFR檢測與組織一致性的薈萃研究XiaoZhaoetal.Respiration2013.血液EGFR檢測與組織顯示較好的一致性比較血清和組織標(biāo)本EGFR突變狀況（86例，ITT）IFUMctDNA研究與IPASS研究日本亞組(血清DNA)分析結(jié)論一致試劑盒：DxSEGFRMutationTestKitforResearchUseOnly(DxS,Manchester,UK),whichcombinesARMSwiththeScorpionsreal-timePCRtechnology.b:2種標(biāo)本EGFR突變狀況已知GotoK.etal.JThoracOncol2012;7(1):115-121

中國樣本量最大的研究Bai,etal.JClinOncol.2009Jun1;27(16):2653-9.敏感性為82%;特異性為92%，血漿、組織檢測的一致性87%

TumorCasenumberEGFR+EGFR-plasmaEGFR+631679EGFR-14137151Casenumber77153230VariableNo.ofpatients

(N=230)%Age,yearsmean60.7standarddeviation4.5Sexmale12353.5female10746.5Smokinghistorysmoker10344.8neversmoker12755.2HistologictypeADC17174.3SCC5523.9LCC418DiseasestageIIIB8034.8IV15065.2Therapychemotherapy230100gefitinib10244.3檢測方法：

High-PerformanceLiquidChromatography多項(xiàng)研究證明攜帶血液EGFR突變患者臨床獲益顯著KunNieetal.TumorBiol2014.VSVSPFSOSEGFR-TKI治療后獲得性耐藥在臨床PD前中位2個(gè)月時(shí)即可在血漿ctDNA中檢測到T790M(范圍：1.5-3.5個(gè)月）血液EGFR的耐藥突變可被提前發(fā)現(xiàn)

ZhengDetal.ASCO2014.Author|00MonthYearSetareadescriptor|Sublevel1Plasma(ARMS)Tumortissue

(ARMS)Total+-+24024-125062Total365086

ddPCR敏感性: 83.3%特異性: 94%一致率: 89.5%Plasma(ddPCR)Tumortissue

(ARMS)Total+-+30333-64753Total365086

AR