基因測序技術分子生物學檢驗技術生物化學檢驗教研室90課件

分子生物學檢驗技術基因測序技術生物化學檢驗教研室學習目標掌握：DNA測序技術的基本原理、主要步驟熟悉：第一代DNA測序技術的體系組成了解：自動化測序的方法目錄雙脫氧鏈末端終止法01化學降解法02自動化測序03CONTENTS分子生物學檢驗技術CONTENTS自動化測序PART03自動化測序新一代測序技術/NGS/高通量測序/二代測序：特點：高通量快速基因組測序、轉錄譜分析、ChIP測序等大規(guī)模DNA測序分析。自動化測序測序平臺測序原理開發(fā)公司454焦磷酸合成測序RocheSolexa、Hiseq邊合成邊測序IlluminaSOLiD連接DNA測序ABI自動化測序自動化測序自動化測序Illumia測序利用可逆終止的熒光dNTP，邊合成邊測序。原理將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面（即Flowcell流動池），這些DNA片段經過延伸和橋式擴增后，在Flowcell上形成了數以億計Cluster，每個Cluster是具有數千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術對待測的模板DNA進行測序。芯片處理Flowcell，流動池8條通道；內表面做了化學修飾：兩種DNA引物種到玻璃表面（共價鍵連接）。兩種DNA引物與DNA文庫的接頭序列互相配對。DNA文庫DNA片段兩端接上人工接頭基因組，打斷，成為片段核苷酸序列不同，未知接頭可以和引物堿基互補配對。DNA文庫橋式PCR將文庫加入到芯片上，進行擴增的過程。通過文庫兩端的人工接頭和芯片上的2種引物互補，從而連接。dNTP和聚合酶作用下，開始延長。形成新的互補DNA鏈。橋式PCR加入NaOH，后解開雙鏈，其中沒有共價結合于芯片上的那條鏈被沖走。加入中性液體，稀釋堿液后，DNA鏈另一端引物與芯片的另一引物配對，形成橋。橋式PCR加入聚合酶和dNTP，在橋上重新合成新鏈。加入堿，將兩條鏈解開。再加入中和液，鏈再與芯片引物雜交。如此反復指數增長測序加入可逆終止的熒光dNTP：鏈接臂熒光基團疊氮基團：阻止聚合，巰基試劑可使疊氮基斷裂，恢復3’羥基。測序邊合成邊測序加入測序引物，可逆dNTP，DNA聚合酶。每次只延長一個堿基。在激光下確定顏色，即哪個堿基。用試劑去掉熒光和疊氮基團。繼續(xù)延長下一個堿基。Illumia1Illumia2Illumia3測序第三代測序技術01它實現了DNA聚合酶內在自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學法測序的2萬倍。它實現了DNA聚合酶內在自身的延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。二代測序現在可以測到上百個堿基，但是三代測序現在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復序列的拼接提供了非常好的條件。02它的精度非常高，達到99.9999%。0304可直接測RNA序列。05可直接測甲基化的DNA序列。自動化測序DNA測序技術經過30多年的發(fā)展，目前已經到了第三代，三代測序技術有各自的優(yōu)勢。第一代測序技術雖然成本高，速度慢，但是對于少量的序列來說，仍是最好的選擇，所以在以后的一段時間內仍將存在；第二代測序技術剛剛商用不久，正在逐漸走向成熟；第三代測序技術有的剛