藥品微生物檢驗技術(shù) 課件 模塊二 項目三 控制菌檢查

《藥品微生物檢驗技術(shù)》模塊二藥品安全性檢查項目三控制菌檢查

任務一銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查

任務二藿香正氣水中金黃色葡萄球菌的檢查

任務三五靈脂中沙門菌的檢查

任務四沙丁胺醇吸入氣霧劑中銅綠假單胞菌的檢查

任務五硝酸益康唑栓中白色念珠菌的檢查

任務六婦必舒陰道泡騰片中梭菌的檢查

目錄項目三控制菌檢查任務一銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查

任務引入請思考銀杏葉片具有活血、化瘀、通絡等作用，主要用于治療心血管類疾病，有降壓、降低膽固醇等功效，且對動脈硬化引起的癡呆等有一定的療效，是老年人常用藥物。這類非無菌藥品在控制菌檢查方面有什么特殊要求呢？

任務分析（１）對大腸埃希菌的檢查為定性檢查，因此需要借助鑒定培養(yǎng)基進行菌種鑒定。（２）按照培養(yǎng)基配方完成培養(yǎng)基制備，并進行適用性檢查，在確保培養(yǎng)基適用于該試驗后，該培養(yǎng)基才能被采用。（３）控制菌檢查需要做方法適用性試驗，以確定該方法是適用于該試驗的。（４）按照《中國藥典》2020年版的規(guī)定，確定銀杏葉片的檢驗數(shù)量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，在無菌室中完成供試品控制菌檢查，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長，并對其進行品種鑒定。任務分析工作內(nèi)容及要求見下表。工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點培養(yǎng)基制備正確選擇培養(yǎng)基，完成制備計算、稱量、調(diào)節(jié)pH值、分裝、滅菌培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備、菌液接種、培養(yǎng)觀察培養(yǎng)基適用性判斷方法適用性試驗供試組、對照組設置方法適用性判斷供試品接種供試品抽樣、接種正確抽樣、試管口無菌操作、培養(yǎng)皿無菌操作、無菌環(huán)境維持對照實驗陽性對照、陰性對照操作對照設計培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)、觀察、記錄大腸埃希菌培養(yǎng)條件、鑒定現(xiàn)象結(jié)果判斷結(jié)果判斷有效結(jié)果、檢品合格結(jié)果相關(guān)知識

控制菌檢查法的檢查對象為非無菌產(chǎn)品，用于檢查供試品中是否存在特定的微生物?！吨袊幍洹?020年版制劑通則要求以動物、植物、礦物來源的非單體成分制成的片劑，生物制品片劑，以及黏膜或皮膚炎癥或腔道等局部用片劑（如口腔貼片、外用可溶片、陰道片、陰道泡騰片等），按照通則1106（非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法）檢查，應符合規(guī)定。控制菌檢查法的檢查對象相關(guān)知識（１）非無菌藥品需要根據(jù)其用藥途徑、目標人群的用藥特點等進行一項或多項控制菌的檢查，以此為患者的用藥安全負責。（２）非無菌藥品中可能的微生物污染來自制水系統(tǒng)、原料、輔料、設備、人員和環(huán)境等，生產(chǎn)的過程控制和生產(chǎn)加工工藝直接影響最終的微生物污染水平，如果在檢驗過程中發(fā)現(xiàn)了控制菌，則表示在某環(huán)節(jié)出現(xiàn)了污染、控制措施處于失控狀態(tài)或生產(chǎn)工藝異常，提示企業(yè)應根據(jù)風險評估結(jié)果進行偏差調(diào)查并采取必要措施?？刂凭鷻z查的意義相關(guān)知識大腸埃希菌為腸桿菌科埃希菌屬細菌，是人和動物體內(nèi)的常住菌，在腸道中可合成維生素B和維生素K。但有些菌株可感染人和動物，引起腹瀉、化膿和敗血癥。大腸埃希菌隨糞便排出體外，污染環(huán)境。藥品受到糞便污染，有可能帶有腸道致病菌或寄生蟲卵等病原體。藥品中檢出大腸埃希菌表明該藥品已受到糞便污染，服用后有可能被病原體感染。大腸埃希菌任務實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責人1培養(yǎng)基制備2培養(yǎng)基適用性檢查3方法適用性試驗4供試品接種5對照試驗6培養(yǎng)及鑒定7結(jié)果判斷根據(jù)任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室操作場所超凈工作臺操作區(qū)域酒精燈局部無菌環(huán)境75%乙醇擦拭消毒銀杏葉片供試品胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、MUG(4-甲基傘形酮葡糖苷酸)營養(yǎng)培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，進行大腸埃希菌的鑒定任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途移液器定量移取供試液試管、試管架容器、支架培養(yǎng)皿容器培養(yǎng)箱細菌培養(yǎng)菌種培養(yǎng)基適用性檢查、檢查方法適用性試驗、陽性對照補充1：補充2：任務實施三、培養(yǎng)基制備按照胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、MUG營養(yǎng)培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基配方，計算實際所需培養(yǎng)基用量，根據(jù)培養(yǎng)基制備方式完成培養(yǎng)基制備。任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪胨17.0g除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g葡萄糖/無水葡萄糖2.5/2.3g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g水1000mL麥康凱液體培養(yǎng)基明膠胰酶水解物20.0g除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ｐＨ值使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分裝，滅菌乳糖10.0g牛膽鹽5.0g溴甲酚紫10.0mg水1000mL任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量麥康凱瓊脂培養(yǎng)基明膠胰酶水解物17.0g除乳糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為7.1±0.2，加入乳糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂，加熱煮沸1min，并不斷振搖，分裝，滅菌胨3.0g乳糖10.0g脫氧膽酸鈉1.5g氯化鈉5.0g中性紅30.0mg結(jié)晶紫1.0mg瓊脂13.5g水1000mL曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100.0ml取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱熔化后，冷卻至６０℃，按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿20%乳糖溶液5.0ml曙紅鈉指示液2.0ml亞甲藍指示液1.3～1.6ml任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量蛋白胨5.0g取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后的pH值為6.6~7.0，分裝于小試管中,121℃滅菌15minMUG培養(yǎng)基牛肉浸膏3.0gMUG0.1G水1000mL磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基蛋白胨7.0g取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)pH值使滅菌后的pH值為7.3±0.1，分裝于小試管中,121℃滅菌15min葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀3.8g水1000mL任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量枸櫞酸鹽培養(yǎng)基氯化鈉5.0g除指示液和瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)pH值使滅菌后的pH值為6.9±0.1，加入瓊脂,加熱溶脹，然后加入指示液，混勻，分裝于小試管中,121℃滅菌15min，制成斜面硫酸鎂0.2g磷酸二氫銨1.0g磷酸氫二鉀1.0g枸櫞酸鈉(無水)2.0g瓊脂14.0g1.0%溴麝香草酚藍指示液10.0mL水1000mL任務實施四、培養(yǎng)基適用性檢查供試品控制菌檢查中所使用的商品化預制培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性。任務實施四、培養(yǎng)基適用性檢查本任務是檢查藥品中是否存在大腸埃希菌，檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑菌能力和指示特性見下表?？刂凭鷻z查培養(yǎng)基特性試驗菌株大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性大腸埃希菌任務實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查具體操作見表。培養(yǎng)基名稱試驗菌培養(yǎng)條件結(jié)果胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h與對照培養(yǎng)基比較

，被檢培養(yǎng)基試驗菌應生長良好麥康凱液體培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌42~44℃培養(yǎng)不超過24h與對照培養(yǎng)基比較

，被檢培養(yǎng)基試驗菌應生長良好不少于100cfu的金黃色葡萄球菌42~44℃培養(yǎng)不少于48h試驗菌應不得生長麥康凱瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落大小

、形態(tài)特征

、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落大小

、形態(tài)特征

、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致MUG營養(yǎng)培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過24h被檢培養(yǎng)基中試驗菌的試驗現(xiàn)象應與對照培養(yǎng)基一致磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過48h被檢培養(yǎng)基中試驗菌的試驗現(xiàn)象應與對照培養(yǎng)基一致枸櫞酸鹽培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過48h被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小

、形態(tài)特征

、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致任務實施五、控制菌檢查方法適用性試驗為確保使用的檢查方法有效，在進行控制菌檢查時需對所用的檢查方法進行適用性試驗。取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。供試液制備方式同微生物計數(shù)法。依相應的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時間下培養(yǎng)，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。本任務中方法適用性試驗所用試驗菌為大腸埃希菌，具體操作見下表。任務實施五、控制菌檢查方法適用性試驗培養(yǎng)基名稱接種方法培養(yǎng)條件胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩管，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1管作為對照30~35℃培養(yǎng)18h麥康凱液體培養(yǎng)基42~44℃培養(yǎng)24h麥康凱瓊脂培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩個平板，其中1個平板接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1平板作為對照30~35℃培養(yǎng)18h曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基30~35℃培養(yǎng)18hMUG營養(yǎng)培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩管，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1管作為對照30~35℃培養(yǎng)24h磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48h枸櫞酸鹽培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩個斜面，其中1個斜面接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1斜面作為對照37℃培養(yǎng)48h任務實施五、控制菌檢查方法適用性試驗上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法適用性試驗。如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抑制作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。任務實施六、供試品檢查大腸埃希菌的檢查流程如下。任務實施七、大腸埃希菌的鑒定-形態(tài)鑒定在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，大腸埃希菌菌落呈桃紅、微紅或中心桃紅，扁平，圓形，光滑濕潤，如下圖所示。由于藥物的影響，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落色澤、質(zhì)地、形態(tài)可能有改變，應挑取多個菌落進行鑒定，切勿遺漏。任務實施七、大腸埃希菌的鑒定-形態(tài)鑒定大腸埃希菌菌落在曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基上呈紫黑色、淺紫色或藍紫色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤，如圖所示。任務實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（1）MUG-Indole試驗。取已培養(yǎng)18～24h的麥康凱液體培養(yǎng)液（供試品管、陽性對照管、陰性對照管）各0.2ml，分別接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)。30~35℃培養(yǎng)5h和24h后在366nm紫外光下各觀察一次，同時取未接種的MUG營養(yǎng)培養(yǎng)基管作為本底對照。若紫外光下管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；若不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。沿管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)（Indole）試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；若液面呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照管和陰性對照管應為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。陽性對照管應為MUG陽性和靛基質(zhì)陽性；否則，試驗無效。任務實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（2）甲基紅（MR）試驗。取可疑菌落接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)2～5天，取1mL培養(yǎng)物加入數(shù)滴甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。陽性反應培養(yǎng)物呈鮮紅色或橘紅色，陰性反應培養(yǎng)物呈黃色。任務實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（3）乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P試驗）。取可疑菌落接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)48h±2h，取2mL培養(yǎng)物加入1mL６%α－萘酚乙醇溶液，混勻，再加入0.4mL40%的NaOH溶液，充分振搖后觀察結(jié)果。培養(yǎng)物在加入試劑后立刻或數(shù)分鐘內(nèi)呈紅色為陽性反應，無紅色為陰性反應。若為陰性反應，置37℃水浴4h后再觀察。任務實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（4）枸櫞酸鹽（Ｃ）利用試驗。取可疑菌落接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h±2h，觀察結(jié)果。斜面有菌生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色為陽性反應；斜面無菌生長，培養(yǎng)基仍是綠色為陰性反應。任務實施八、銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查步驟序號步驟操作內(nèi)容1取樣及樣品處理按照《中國藥典》2020年版規(guī)定的檢驗數(shù)量進行抽樣，一般應隨機抽取不少于

個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為

。取供試品，用

溶解或稀釋制成1:10供試液。2增菌培養(yǎng)取10mL供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，

℃培養(yǎng)

h。3分離與純培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物

mL接種至100mL

培養(yǎng)基中，

℃培養(yǎng)

h。取

培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~72h。4形態(tài)檢查與鑒別培養(yǎng)及制備在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，大腸埃希菌菌落呈

，扁平，圓形，光滑濕潤；在曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基平板上，大腸埃希菌菌落呈

，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有

。任務實施八、銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查步驟序號步驟操作內(nèi)容5生化鑒定MUG-Indole試驗：取已培養(yǎng)18~24h的麥康凱液體培養(yǎng)物

mL,接種至

mLMUG營養(yǎng)培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)

h和

h后在366nm紫外光下各觀察一次。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG

;若不呈現(xiàn)熒光，為MUG

。然后沿管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)

；若呈試劑本色，為靛基質(zhì)

。甲基紅(MR)試驗：取可疑菌落接種于

培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)2~5天，取1mL培養(yǎng)物加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。陽性反應培養(yǎng)物呈鮮紅色或橘紅色，陰性反應培養(yǎng)物呈

。乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P試驗）：取可疑菌落接種于

培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)48h±2h,取2mL培養(yǎng)物加入1mL6%α-萘酚乙醇溶液，混勻，再加入0.4mL40%的NaOH溶液后觀察結(jié)果。培養(yǎng)物在加入試劑后的4h內(nèi)呈

為陽性反應，無

為陰性反應。枸櫞酸鹽(C)利用試驗：取可疑菌落接種于

培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h±2h,觀察結(jié)果。斜面有菌生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)?/p>

為陽性反應；斜面無菌生長，培養(yǎng)基仍是綠色為陰性反應。任務測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分1培養(yǎng)基制備能正確計算培養(yǎng)基各組分用量5能正確配制培養(yǎng)基10能完成培養(yǎng)基滅菌操作52培養(yǎng)基適用性檢查能制備各菌種的菌液10能將菌液接種至相應的培養(yǎng)基中10能正確判斷培養(yǎng)基適用性53控制菌檢查方法適用性試驗能完成控制菌檢查方法適用性試驗5能判斷該方法是否可行并改進54控制菌檢查能用無菌操作技術(shù)完成供試品中控制菌檢查各項操作10能正確觀察供試品各類現(xiàn)象并判斷結(jié)果10能正確判斷供試品是否檢出控制菌105培養(yǎng)物處理、無菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理10能正確完成無菌室清潔5合計100項目三控制菌檢查任務二藿香正氣水中金黃色葡萄球菌的檢查

任務引入請思考葡萄球菌屬細菌是一群革蘭氏陽性球菌，在顯微鏡下，它們?yōu)榍蛐危ㄇ蚓逊e排列呈葡萄串狀，故名葡萄球菌。葡萄球菌感染可引起各種化膿性炎癥，可波及全身引起敗血癥、膿毒血癥等；還有由外毒素引起的中毒性疾病，如食物中毒、燙傷樣皮膚綜合征、毒性休克綜合征等?？股貥藴势返男r單位是明確標明的。配制標準品溶液時稱量的標準品數(shù)量無法預先確定，如何根據(jù)標準品的稱量數(shù)量計算出緩沖液的用量，配制出準確濃度的抗生素標準品溶液？那么怎樣進行藥品的金黃色葡萄球菌的檢查呢？任務分析通過對藿香正氣水中金黃色葡萄球菌檢查，學習一下怎樣進行金黃色葡萄球菌檢查，工作內(nèi)容及要求見下表。工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點培養(yǎng)基制備選擇正確培養(yǎng)基、完成制備計算、稱量、調(diào)節(jié)PH、分裝、滅菌培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)抽檢培養(yǎng)基放置相應培養(yǎng)箱觀察是否有菌生長培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備、菌液接種、培養(yǎng)觀察微量移液器使用、適用性判斷方法適用性試驗供試組、對照組設置方法適用性判斷供試品接種供試品抽樣、接種正確抽樣、無菌操作無菌環(huán)境維持對照實驗陽性對照、陰性對照操作對照設計培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)、觀察、記錄培養(yǎng)條件結(jié)果判斷結(jié)果判斷有效結(jié)果、檢品合格結(jié)果相關(guān)知識

控制菌檢查法是利用相應培養(yǎng)基在適宜條件下給相應菌種提供所需營養(yǎng)，使其良好生長。金黃色葡萄球菌檢查采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)，再取增菌液在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。一、控制菌檢查法相關(guān)知識

二、操作重難點環(huán)節(jié)操作環(huán)節(jié)描述培養(yǎng)基的制備根據(jù)所需培養(yǎng)基用量計算培養(yǎng)基各組分用量、培養(yǎng)基121℃高壓蒸汽滅菌15~20分鐘無菌環(huán)境的創(chuàng)造與維持操作前后對超凈工作臺進行酒精擦拭滅菌、穿好防護服、避免染菌操作、定期清潔無菌室移液器的無菌操作取液時槍頭內(nèi)不出現(xiàn)氣泡、勤于更換槍頭培養(yǎng)過程觀察培養(yǎng)基任務實施一、制訂工作計劃根據(jù)任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。序號工作內(nèi)容完成時間成員負責人1培養(yǎng)基制備

2培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)

3培養(yǎng)基適用性檢查

4方法適用性試驗

5供試品接種

6對照實驗

7培養(yǎng)及鑒定

8結(jié)果判斷

任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途培養(yǎng)基制備

操作場所培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)

操作區(qū)域培養(yǎng)基適用性檢查

局部無菌環(huán)境方法適用性試驗

擦拭消毒供試品接種

供試品對照實驗

為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)及鑒定

移取定量供試品結(jié)果判斷

容器、支架培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)

適用性檢查、陽性對照任務實施三、試驗操作培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000ml實際用量___ml各組分用量計算各組分用量胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）胰酪胨17.0g

氯化鈉5.0g

大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g

磷酸氫二鉀2.5g

葡萄糖2.5g

pH7.3±0.2(25℃)

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（MSA）胰酪胨5.0g

L-胱氨酸0.5g

酚紅25mg

酶水解物5.0g

氯化鈉75.0g

瓊脂35g

牛肉浸出粉1.0g

動物組織胃蛋白

D-甘露醇10.0g

pH7.4±0.2(25℃)

除甘露醇、酚紅、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.4±0.2，加入并振蕩，加入甘露醇、酚紅、瓊脂，煮沸1分鐘，分裝，滅菌。若在室溫下放置，菌液應在2小時內(nèi)使用，若保存在2~8℃，可在24小時內(nèi)使用。菌液貯存條件控制菌檢查用的商品化預制培養(yǎng)基、脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應進行培養(yǎng)基的適用性檢查。培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查，以確認培養(yǎng)基是否適合于控制菌的檢查。培養(yǎng)基適用性檢查內(nèi)容培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基名稱特性使用菌株培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間結(jié)果判斷甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長能力不大于100cfu金黃色葡萄球菌30~35℃不超過18小時被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應一致指示特性抑制能力不大于lOOcfu大腸埃希菌30~35℃至少24小時試驗菌應不得生長任務實施根據(jù)各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應試驗菌株，確認金黃色葡萄球菌檢查方法時，采用金黃色葡萄球菌試驗菌。試驗菌控制菌檢查方法適用性試驗按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液10ml及不大于100cfu的金黃色葡萄球菌試驗菌接入甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中。依金黃色葡萄球菌檢查方法，在30-35℃培養(yǎng)18小時，應能檢出金黃色葡萄球菌。適用性試驗供試液接種后，按“微生物回收”規(guī)定的方法進行微生物計數(shù)。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)值的50％，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性?？咕钚缘娜コ驕缁钊蝿諏嵤┡囵B(yǎng)基名稱接種菌種接種方法培養(yǎng)甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基不大于l00cfu金黃色葡萄球菌菌種各兩管，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照置于30-35℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間18小時結(jié)果判斷與對照培養(yǎng)基比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。適用性試驗操作方案任務實施任務實施供試品檢查1.陽性對照試驗2.陰性對照試驗3.供試品的采集如果從外觀已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生霉、長螨、蟲蛀或變質(zhì)的藥品，直接判為不合格，不必抽樣檢查，抽樣要求如下表。序號抽樣要求1須采用無菌操作技術(shù)進行取樣，防止樣品受到微生物污染而導致假陽性的結(jié)果2抽樣的任何消毒過程（如抽樣點的消毒）不能影響樣品中微生物的檢出3抽樣容器應貼有唯一性的標識，注明樣品名稱、批號、抽樣日期、采樣容器、抽樣人等4抽樣應由經(jīng)過培訓的人員使用無菌設備在無菌條件下進行無菌操作5抽樣環(huán)境應監(jiān)測并記錄，同時還需記錄采樣時間任務實施供試品檢查4.供試品取樣

檢驗量：檢驗量即一次試驗所用的供試品數(shù)量(g、ml或cm2)。一般應隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml。

藿香正氣水金黃色葡萄球菌檢查的檢驗量為10ml。5.供試品的接種培養(yǎng)與判斷培養(yǎng)基供試品接種原則陽性對照陰性對照培養(yǎng)條件胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基藿香正氣水每個試管接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。接種與供試品等量的金黃色葡萄球菌（不大于lOOcfu）至培養(yǎng)基中用等量處理供試液的稀釋液代替供試品接種于培養(yǎng)基中胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基試管置30~35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24小時甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基接種與供試品等量的金黃色葡萄球菌（不大于lOOcfu）至培養(yǎng)基中培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~72小時任務測評鑒定與結(jié)果判斷革蘭氏染色細菌的革蘭氏染色步驟：涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察血漿凝固酶試驗試管法取無菌小試管(10mm×10mm)3支，各加入新鮮兔血漿和0.9%無菌氯化鈉1:1稀釋液0.5m，1支加人供試液純培養(yǎng)物的菌懸液0.5ml，其余2支作對照管，1支加入營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉液0.5ml作陰性對照，一支加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml作陽性對照。三管同時置36℃士1℃水浴或培養(yǎng)箱中，3h后開始檢查，以后每隔適當時間觀察1次直至24h，檢查時輕輕將試管傾斜，不要動作過快，仔細觀察，陰性對照管應流動自如，陽性對照管呈凝固狀，供試品管呈凝固狀者為陽性反應，不凝固者為陰性反應陽性對照和陰性對照管任一管不符合要求時，應另制備血漿重新試驗。1.表型鑒定任務測評鑒定與結(jié)果判斷陽性供試品分離菌革蘭染色鏡檢呈陽性球菌，血漿凝固酶試驗呈陽性反應，報告1ml藿香正氣水供試品檢出金黃色葡萄球菌。陰性革蘭染色鏡檢不是革蘭陽性球菌或血漿凝固酶試驗呈陰性反應，報告1ml藿香正氣水供試品未檢出金黃色葡萄球菌。2.結(jié)果判斷項目三控制菌檢查

任務三五靈脂中沙門菌的檢查

任務引入請思考五靈脂是一種活血化瘀藥，其功效為活血止痛、祛瘀止血，對于一些出血性疾病或跌打損傷有良好的效果。這類非無菌藥品在控制菌檢查方面有什么特殊要求呢？

任務分析（１）沙門菌被列為污染指示菌，是非無菌口服藥品的常規(guī)必檢項目。五靈脂中沙門菌的檢查為定性檢查，因此需要借助鑒定培養(yǎng)基進行菌種鑒定。（２）按照培養(yǎng)基配方完成培養(yǎng)基制備并進行適用性檢查，在確保培養(yǎng)基適用于該試驗后，該培養(yǎng)基才能被采用。（３）控制菌檢查方法需要做方法適用性試驗，以確定該方法是適用于該試驗的。（４）按照《中國藥典》2020年版規(guī)定，確定五靈脂的檢驗數(shù)量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，在無菌室中完成供試品控制菌檢查，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長并對其進行品種鑒定來判斷結(jié)果。相關(guān)知識沙門菌為腸桿菌科沙門菌屬細菌，廣泛分布于自然界，是人畜共患的腸道病原菌，常引起胃腸炎、傷寒等，危害人類健康。沙門菌可通過人、畜、禽的糞便或帶菌者直接或間接地污染藥品原料、輔料及生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，特別是以動物為來源的藥物，污染概率更高。沙門菌

相關(guān)知識沙門菌的檢查流程如下：任務實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責人1培養(yǎng)基制備2培養(yǎng)基適用性檢查3方法適用性試驗4供試品接種5對照試驗6培養(yǎng)及鑒定7結(jié)果判斷根據(jù)任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室操作場所超凈工作臺操作區(qū)域酒精燈局部無菌環(huán)境75%乙醇擦拭消毒五靈脂供試品胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、尿素瓊脂培養(yǎng)基、氰化鉀培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，進行沙門菌的鑒定任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途移液器定量移取供試液試管、試管架容器、支架培養(yǎng)皿容器培養(yǎng)箱微生物培養(yǎng)菌種培養(yǎng)基適用性檢查、檢查方法適用性試驗、陽性對照補充1：補充2：任務實施三、培養(yǎng)基制備按照胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、尿素瓊脂培養(yǎng)基、氰化鉀培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方，計算實際所需培養(yǎng)基用量，根據(jù)培養(yǎng)基制備方式完成培養(yǎng)基制備。任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪胨17.0g除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g葡萄糖/無水葡萄糖2.5/2.3g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g水1000.0mLRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基大豆胨4.5g除孔雀綠外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為5.2±0.2。加入孔雀綠，分裝，滅菌，滅菌溫度不能超過115℃。氯化鈉8.0g磷酸氫二鉀0.4g磷酸二氫鉀0.6g六水合氯化鎂29.0g孔雀綠36.0mg水1000.0mL任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基酵母浸出粉3.0g除三種糖、酚紅、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使加熱后在25℃的pH值為7.4±0.2,加入三種糖、酚紅、瓊脂，加熱至沸騰，冷至50℃傾注平皿（不能在高壓滅菌器中加熱）。L-賴氨酸5.0g木糖3.5g乳糖7.5g蔗糖7.5g脫氧膽酸鈉2.5g氯化鈉5.0g硫代硫酸鈉6.8g枸櫞酸鐵銨0.8g酚紅80.0mg瓊脂13.5g水1000.0mL任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基胨20.0g除三種糖、0.2%酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層(2~3cm)短斜面。牛肉浸出粉5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g氯化鈉5.0g硫酸亞鐵0.2g硫代硫酸鈉0.2g0.2%酚磺酞指示液12.5mL瓊脂12.0g水1000.0mL任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量尿素瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨1.0g除尿素溶液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為7.2±0.2,加入瓊脂，加熱溶化后，冷卻至50~55℃,再加入過濾除菌的尿素溶液，尿素終濃度為2%,分裝，制成斜面。葡萄糖1.0g酚紅0.012g氯化鈉5.0g磷酸二氫鉀2.0g瓊脂20.0g20%尿素溶液100.0mL水900.0mL氰化鉀培養(yǎng)基蛋白胨10.0g除氰化鉀外，取上述成分，混合，微溫溶解后滅菌，充分冷卻后加入新制備的0.5%氰化鉀溶液，分裝（氰化鉀是劇毒藥，使用時應小心，切勿沾染，以免中毒）。氯化鈉5.0g磷酸二氫鉀0.225g磷酸氫二鈉5.64g0.5%氰化鉀溶液20.0mL水1000.0mL任務實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基蛋白胨5.0g除賴氨酸外，取上述成分，混合，加熱溶解，加入L-賴氨酸，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為6.8±0.2,分裝，115℃高壓滅菌。酵母浸出粉3.0gL-賴氨酸5.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.02g水1000.0mL半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10.0g除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)pH值使滅菌后在75℃的pH值為7.4±0.2,再加入瓊脂，加熱溶解，分裝，滅菌。牛肉浸出粉3.0g氯化鈉5.0g瓊脂3.0~6.5g水1000.0mL任務實施四、培養(yǎng)基適用性檢查沙門菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抵制能力和指示特性見下表?？刂凭鷻z查培養(yǎng)基特性試驗菌株沙門菌RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基促生長能力乙型副傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性乙型副傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基指示能力乙型副傷寒沙門菌任務實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查具體操作見表。培養(yǎng)基名稱試驗菌培養(yǎng)條件結(jié)果胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h與對照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基試驗菌應生長良好RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h與對照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基試驗菌應生長良好不少于100cfu的金黃色葡萄球菌30~35℃培養(yǎng)不少于24h試驗菌應不得生長木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致尿素瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過24h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致氰化鉀培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過48h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的試驗現(xiàn)象應與對照培養(yǎng)基一致賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過24h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的試驗現(xiàn)象應與對照培養(yǎng)基一致半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌30~35℃培養(yǎng)不超過24h與對照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基試驗菌應生長良好任務實施五、控制菌檢查方法適用性試驗培養(yǎng)基名稱接種菌種接種方法培養(yǎng)條件胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌每種菌種各兩管，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1管作為對照30~35℃培養(yǎng)18hRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌每種菌種各兩個平板，其中1個平板接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1平板作為對照30~35℃培養(yǎng)18h三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基尿素瓊脂培養(yǎng)基30~35℃培養(yǎng)24h氰化鉀培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌取規(guī)定量供試液與試驗菌接種于氰化鉀培養(yǎng)基及不含氰化鉀的基礎培養(yǎng)基（對照管）中，接種后立即塞緊橡膠塞30~35℃培養(yǎng)24h賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌取規(guī)定量供試液與試驗菌接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及不含賴氨酸脫羧酶的基礎培養(yǎng)基（對照管）中30~35℃培養(yǎng)24h半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的乙型副傷寒沙門菌取規(guī)定量供試液與試驗菌穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中30~35℃培養(yǎng)24h任務實施五、控制菌檢查方法適用性試驗試驗名稱接種菌種操作方法血清凝集試驗乙型副傷寒沙門菌在潔凈載玻片一端，以接種環(huán)蘸取沙門菌屬多價菌體(O)抗血清2~3環(huán)，再取規(guī)定量供試液與乙型副傷寒沙門菌少許，與血清混合，將玻片前后晃動，載玻片另一端應以0.9%無菌氯化鈉溶液與同株培養(yǎng)物混合作對照試驗。結(jié)果判斷若檢出試驗菌，則說明該方法可行，可按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查。若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法適用性試驗。如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。任務實施六、供試品檢查五靈脂中沙門菌檢查方法如下。培養(yǎng)基供試品陽性對照陰性對照培養(yǎng)條件胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基五靈脂供試液分別接種與供試品等量的乙型副傷寒沙門菌（不大于100cfu)至培養(yǎng)基中用等量處理供試品的稀釋液代替供試品接種于培養(yǎng)基中30~35℃培養(yǎng)18~24hRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基供試液培養(yǎng)物分別接種與供試品等量的乙型副傷寒沙門菌（不大于100cfu)至培養(yǎng)基中30~35℃培養(yǎng)18~24h木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物分別接種與供試品等量的乙型副傷寒沙門菌（不大于100cfu)至培養(yǎng)基平板上用等量處理供試品的稀釋液代替供試品接種于培養(yǎng)基平板上30~35℃培養(yǎng)18~48h三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基上淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色的菌落分別接種與供試品等量的乙型副傷寒沙門菌（不大于100cfu)至培養(yǎng)基平板上30~35℃培養(yǎng)18~24h任務實施七、沙門菌的鑒定-形態(tài)鑒定沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落呈淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。任務實施七、沙門菌的鑒定-生化鑒定（1）靛基質(zhì)試驗。參照本項目任務一大腸埃希菌生化鑒定中本項操作并判斷結(jié)果。任務實施七、沙門菌的鑒定-生化鑒定（2）尿素酶試驗。取疑似菌落接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基斜面，30~35℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。斜面變?yōu)榧t色為陽性，不變色為陰性。任務實施七、沙門菌的鑒定-生化鑒定（3）氰化鉀試驗。用接種環(huán)蘸取疑似菌落，分別接種至氰化鉀培養(yǎng)基及不含氰化鉀的基礎培養(yǎng)基（對照管）各1管，接種后立即塞緊橡膠塞，置30~35℃培養(yǎng)24~48h,對照管內(nèi)應有菌生長，試驗管有菌生長者為陽性，試驗管無菌生長者為陰性。任務實施七、沙門菌的鑒定-生化鑒定（4）賴氨酸脫羧酶試驗。用接種環(huán)蘸取疑似菌落分別接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及不含賴氨酸脫羧酶的基礎培養(yǎng)基（對照管），置30~35℃培養(yǎng)24~48h,觀察結(jié)果。對照管應為黃色，試驗管呈紫色為陽性（賴氨酸脫羧產(chǎn)堿），試驗管呈黃色為陰性。任務實施七、沙門菌的鑒定-生化鑒定（5）動力檢查。用接種針蘸取疑似菌落穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)24h,細菌沿穿刺線外周擴散生長為動力陽性，否則為陰性。陰性培養(yǎng)物應在室溫保留2~3天后，再判斷。任務實施七、沙門菌的鑒定-生化鑒定（6）血清凝集試驗。在潔凈載玻片一端，以接種環(huán)蘸取沙門菌屬多價菌體(O)抗血清2~3環(huán)，再取疑似菌落少許，與血清混合，將玻片前后晃動，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為陽性反應，載玻片另一端應以0.9%無菌氯化鈉溶液與同株培養(yǎng)物混合作對照試驗，對照試驗應無凝集現(xiàn)象。有時反應遲緩，需將玻片與濕棉球置培養(yǎng)皿內(nèi)，約過20min,再觀察。仍未出現(xiàn)凝集時，應取疑似菌落，置含少量0.9%無菌氯化鈉溶液的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30min,待冷，再作凝集試驗。任務實施八、五靈脂中沙門菌的檢查步驟序號步驟操作內(nèi)容1取樣及樣品處理按照《中國藥典》2020年版規(guī)定的檢驗數(shù)量進行抽樣，一般應隨機抽取不少于

個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為

。取供試品，用

溶解或稀釋制成1:10供試液。2增菌培養(yǎng)取10mL供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，

℃培養(yǎng)

h。3選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物

mL接種至10mL

培養(yǎng)基中，

℃培養(yǎng)

h。取

培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基平板上，

℃培養(yǎng)

h。用接種針挑

于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，

℃培養(yǎng)

h。4形態(tài)檢查在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上沙門菌菌落呈

，接種至三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基后斜面呈

。任務實施八、五靈脂中沙門菌的檢查步驟序號步驟操作內(nèi)容5生化鑒定1.靛基質(zhì)試驗2.尿素酶試驗取疑似菌落接種于

斜面，

℃培養(yǎng)

h觀察結(jié)果。斜面變?yōu)榧t色為

性，不變色為

性。3.氰化鉀試驗用接種環(huán)蘸取疑似菌落，分別接種至

及

各1管，接種后立即塞緊橡膠塞，置

℃培養(yǎng)

h,對照管內(nèi)應有菌生長，試驗管有菌生長者為

性，試驗管無菌生長者為

性。4.賴氨酸脫羧酶試驗用接種環(huán)蘸取疑似菌落分別接種于

及

，置

℃培養(yǎng)

h,觀察結(jié)果。對照管應為黃色，試驗管呈紫色為

性（賴氨酸脫羧產(chǎn)堿），試驗管呈黃色為

性。任務實施八、五靈脂中沙門菌的檢查步驟序號步驟操作內(nèi)容5生化鑒定5.動力檢查用接種針蘸取疑似菌落穿刺接種于

中，

℃培養(yǎng)

h,細菌沿穿刺線外周擴散生長，為動力

性，否則為

性。

性培養(yǎng)物應在室溫保留2~3天后，再判斷。6.血清凝集試驗在潔凈載玻片一端，以接種環(huán)蘸取

2~3環(huán)，再取疑似菌落少許，與血清混合，將玻片前后晃動，以

與

作對照試驗，對照試驗應無凝集現(xiàn)象。有時反應遲緩，需將玻片與濕棉球置平皿內(nèi)，約過20min,再觀察。仍未出現(xiàn)凝集時，應取疑似菌落，置含少量0.9%無菌氯化鈉溶液的試管中，制成

,在

℃水浴中保溫

min,待冷，再作凝集試驗。如出現(xiàn)凝集，應判為

性，否則為

性。任務測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分1培養(yǎng)基制備能正確計算培養(yǎng)基各組分用量5能正確配制培養(yǎng)基10能完成培養(yǎng)基滅菌操作52培養(yǎng)基適用性檢查能制備各菌種的菌液10能將菌液接種至相應的培養(yǎng)基中10能正確判斷培養(yǎng)基適用性53控制菌檢查方法適用性試驗能完成控制菌檢查方法適用性試驗5能判斷該方法是否可行并改進54控制菌檢查能用無菌操作技術(shù)完成供試品中控制菌檢查各項操作10能正確觀察供試品各類現(xiàn)象并判斷結(jié)果10能正確判斷供試品是否檢出控制菌105培養(yǎng)物處理、無菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理10能正確完成無菌室清潔5合計100項目三控制菌檢查

任務四沙丁胺醇吸入氣霧劑中銅綠假單胞菌的檢查

任務引入請思考某企業(yè)生產(chǎn)了一批沙丁胺醇吸入氣霧劑，需要按照抽樣標準抽取一定數(shù)量，并對這一批抽檢品是否含有銅綠假單胞菌進行判斷。因單個微生物肉眼不可見，不能直觀做出判斷，故需要借助培養(yǎng)基將微生物培養(yǎng)成肉眼可見的菌落，再進行鑒別。任務分析（１）藥品中銅綠假單胞菌的含菌量較少，檢出銅綠假單胞菌的第一步是增菌培養(yǎng)。增菌是為了讓目標菌大量繁殖，以增加目標菌的檢出率。（２）銅綠假單胞菌的生長對營養(yǎng)要求不高，待檢驗樣品有正常菌群存在時，應接種至選擇性培養(yǎng)基，如溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基；無正常菌群存在時（如血液等），可接種至普通全營養(yǎng)型培養(yǎng)基。為了得到單個疑似菌落，應采用平板劃線分離法。（３）為進一步鑒定平板上生長的菌落是否為銅綠假單胞菌，需進行氧化酶試驗等生化鑒定試驗。

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，是一種機會性致病菌，當人體免疫力下降時，銅綠假單胞菌就可以轉(zhuǎn)為致病菌。相關(guān)知識-銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性菌，菌體細長且長短不一，呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列。

鏡檢下不同培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌的菌落形態(tài)不同

菌落形態(tài)相關(guān)知識-銅綠假單胞菌

菌落形態(tài)培養(yǎng)基菌落形態(tài)血瓊脂培養(yǎng)基大而扁平，濕潤，有金屬光澤，菌落周圍有藍綠色透明溶血環(huán)，有生姜味麥康凱瓊脂培養(yǎng)基典型菌落：菌落形態(tài)不規(guī)則，邊緣呈傘狀伸展大腸菌樣型：菌落圓形凸起，無色透明，似大腸埃希菌粗糙型：菌落呈紐扣狀，表面粗糙，或菌落中央隆起、邊緣扁平黏液型：菌落光滑，隆起，呈黏液狀，嵌入培養(yǎng)基中，不易挑起侏儒型：生長緩慢，培養(yǎng)24ｈ后才有細小菌落普通培養(yǎng)基產(chǎn)生水溶性色素，如綠膿素和水溶性熒光素相關(guān)知識-銅綠假單胞菌

溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基鑒別銅綠假單胞菌的原理組成成分作用明膠胰酶水解物為銅綠假單胞菌的生長提供碳、氮源、維生素和生長因子甘油溴化十六烷基三甲銨用于銅綠假單胞菌的選擇培養(yǎng)。溴化十六烷基三甲銨可以改變細菌細胞的通透性，使細菌發(fā)生自溶或引起菌體蛋白質(zhì)變性沉淀，導致細菌死亡，有較強的抑菌作用，而銅綠假單胞菌對其有一定的耐受性氯化鎂促進綠膿菌素的產(chǎn)生，并維持滲透壓硫酸鉀瓊脂凝固劑水溶解上述成分相關(guān)知識-銅綠假單胞菌檢查

重點操作環(huán)節(jié)操作環(huán)節(jié)描述供試液的制備和增菌無菌操作制備1:10供試液選擇與分離培養(yǎng)將增菌培養(yǎng)物劃線接種于相應培養(yǎng)基氧化酶試驗新制備1%二鹽酸Ｎ,Ｎ-二甲基對苯二胺試液，把握培養(yǎng)物顏色變化時間綠膿菌素試驗攪碎培養(yǎng)基并充分振搖，使培養(yǎng)物中的色素提取至氯仿中硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗判斷培養(yǎng)基管中是否有氣體產(chǎn)生培養(yǎng)過程把握培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時間結(jié)果判斷科學準確地判斷實驗結(jié)果任務實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責人1培養(yǎng)基制備

2培養(yǎng)基適用性檢查

3方法適用性試驗

4供試品制備5增菌培養(yǎng)6分離培養(yǎng)7菌落形態(tài)鑒別后續(xù)根據(jù)任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責人8氧化酶試驗

9綠膿菌素試驗

10硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗

1142℃生長試驗12明膠液化試驗13結(jié)果判斷根據(jù)任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室

操作場所超凈工作臺

操作區(qū)域酒精燈

局部無菌環(huán)境75%乙醇

擦拭消毒沙丁胺醇吸入氣霧劑

供試品溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板

銅綠假單胞菌的選擇培養(yǎng)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

增菌培養(yǎng)試管、試管架

容器、支架培養(yǎng)箱

微生物培養(yǎng)接種環(huán)

接種菌種靈敏度檢查、陽性對照任務實施三、試驗操作培養(yǎng)基的制備按照溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基與胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配方，計算實際所需培養(yǎng)基用量，根據(jù)培養(yǎng)基制備方式完成培養(yǎng)基制備。任務實施三、試驗操作培養(yǎng)基適用性檢查檢查項接種方法結(jié)果判斷促生長能力用涂布法分別接種不大于100cfu的銅綠假單胞菌于溴化十六烷基三甲銨培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應一致抑制能力接種不少于100cfu的大腸埃希菌于溴化十六烷基三甲銨培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不小于規(guī)定的最長培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，試驗菌應不得生長任務實施三、試驗操作方法適用性試驗操作方案培養(yǎng)基接種菌種接種方法培養(yǎng)溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的銅綠假單胞菌接種規(guī)定量的試驗菌與供試液，并以僅接種試驗菌的培養(yǎng)基作為對照30～35℃培養(yǎng)18～72小時結(jié)果判斷含供試的培養(yǎng)基中若檢出試驗菌，按此供試液制備方法與控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出，應消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法適用性試驗對照培養(yǎng)基中試驗菌應生長良好。任務實施三、試驗操作供試品檢查供試液制備

取沙丁胺醇吸入氣霧劑，按任務一大腸埃希菌檢查中介紹的氣霧劑供試品的供試液制備方法制成1:10供試液，取相當于1ｇ或1ｍＬ供試品的供試液，接種至適宜體積的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。任務實施三、試驗操作供試品檢查選擇分離和培養(yǎng)（１）供試品：取增菌培養(yǎng)液，劃線接種至溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。（２）陽性對照：接種與供試品等量的銅綠假單胞菌（不大于100cfu）至溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。陽性對照應檢出銅綠假單胞菌。（３）陰性對照：以等量pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液代替供試液，接種至至溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。應無菌生長。任務實施三、試驗操作銅綠假單胞菌的鑒定氧化酶試驗

將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取上述培養(yǎng)基上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸Ｎ,Ｎ-二甲基對苯二胺試液，在30s內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。任務實施三、試驗操作銅綠假單胞菌的鑒定綠膿菌素試驗取疑似菌落，接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基斜面上，置36℃±１℃培養(yǎng)24h后，在試管內(nèi)加氯仿3～5ｍＬ，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖，使培養(yǎng)物中的色素提取至氯仿中。靜置片刻，將氯仿移至另1試管中，加入1mol/ＬHCl試液約1mＬ，振搖后，靜置片刻，如在HCl液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為綠膿菌素陽性，試驗同時應做陰性對照。任務實施三、試驗操作銅綠假單胞菌的鑒定硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗以接種環(huán)蘸取疑似菌落，接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36℃±１℃培養(yǎng)24ｈ，觀察結(jié)果。若在培養(yǎng)基的小導管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并產(chǎn)生氮氣。任務實施三、試驗操作銅綠假單胞菌的鑒定42℃生長試驗用接種環(huán)蘸取疑似菌落，接種于0.9％無菌氯化鈉溶液中，制成菌懸液，再取菌懸液接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，立即置41℃±１℃水浴中培養(yǎng)24～48ｈ，有菌苔生長者為陽性，否則為陰性。任務實施三、試驗操作銅綠假單胞菌的鑒定明膠液化試驗用接種針蘸取疑似菌落，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36℃±１℃培養(yǎng)24ｈ，取出置冰箱冷藏室內(nèi)10～30min，若培養(yǎng)基仍呈溶液狀，即為明膠液化試驗陽性；如培養(yǎng)基凝固，為陰性反應。任務實施三、結(jié)果判斷若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如果平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。若綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌；或綠膿菌素試驗陰性，硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、42℃生長試驗、明膠液化試驗均陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。項目三控制菌檢查

任務五硝酸益康唑栓中白色念珠菌的檢查

任務引入請思考

硝酸益康唑栓為乳白色至微黃色的栓劑，可用于治療念珠菌性陰道炎，給藥方式為陰道給藥，一般睡前使用，置于陰道深處。這類藥物的控制菌檢查有什么要求呢？任務分析硝酸益康唑栓控制菌檢查項目包括白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。本任務以硝酸益康唑栓為例，介紹白色念珠菌的檢查方法。硝酸益康唑栓本身為抗真菌藥，在做控制菌檢查時需先去除或中和其抗菌活性。任務分析相關(guān)知識

白色念珠菌又稱白色假絲酵母菌，是一種雙相真菌，即不同條件下有不同的形態(tài)學特征。正常情況下為酵母相，菌體呈圓形或卵圓形；致病時表現(xiàn)為菌絲相，菌絲是菌體獲取營養(yǎng)的重要結(jié)構(gòu)，芽管有助于菌體更加牢固地附著于人體組織。

芽管試驗為白色念珠菌的鑒定試驗。正常使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)白色念珠菌時通常不會生成芽管，需要用血清或特殊培養(yǎng)基在35~37℃水浴2~4h，才可通過鏡檢觀察到芽管產(chǎn)生。任務實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責人1培養(yǎng)基制備

2培養(yǎng)基適用性檢查

3方法適用性試驗

4供試液制備5接種與培養(yǎng)6對照試驗7鑒定試驗8結(jié)果判斷根據(jù)任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室

操作場所超凈工作臺

操作區(qū)域酒精燈

局部無菌環(huán)境75%乙醇

擦拭消毒硝酸益康唑栓

供試品沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、念珠菌顯色培養(yǎng)基、1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基

為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)、進行白色念珠菌的鑒定移液器

定量移取供試液試管、試管架

容器、支架培養(yǎng)箱

真菌培養(yǎng)菌種

培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗、陽性對照顯微鏡

形態(tài)觀察

載玻片

白色念珠菌的鑒定

蓋玻片

血清

補充1：

補充2：

任務實施三、試驗操作培養(yǎng)基制備按照沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、念珠菌顯色培養(yǎng)基配方，計算實際所需培養(yǎng)基用量，根據(jù)培養(yǎng)基制備方式完成培養(yǎng)基制備。任務實施三、試驗操作培養(yǎng)基適用性檢查任務實施三、試驗操作控制菌檢查方法適用性試驗任務實施三、試驗操作供試品檢查供試液制備硝酸益康唑栓為油脂類供試品，制備時應加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使其乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃（特殊情況下，最多不超過45℃），小心混合，若需要可在水浴中進行。加熱時應注意均勻加熱，且溫度應不超過45℃。然后加入預熱的稀釋液使成1:10供試液，保溫，混合，并在最短時間內(nèi)形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10倍系列稀釋。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1h。增菌培養(yǎng)取相當于1g或1ml硝酸益康唑栓的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，混勻，30~35℃培養(yǎng)3~5天。陽性對照陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，白色念珠菌的加量應不大于100cfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照以稀釋液代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應無菌生長。選擇、分離培養(yǎng)分別取供試品組、陽性對照組、陰性對照組的預培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)24~48h。挑取疑似菌落接種至念球菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24~48h（必要時延長至72h）。并進行后續(xù)鑒定。任務實施三、試驗操作白色念珠菌的鑒定1.革蘭染色法:挑取念球菌顯色培養(yǎng)基平板上為綠色或翠綠色的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物進行革蘭染色后觀察染色結(jié)果。白色念珠菌革蘭染色結(jié)果為陽性，菌體呈紫色。2.芽管試驗:挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，混勻，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿上，于35～37℃培養(yǎng)1～3h后，置顯微鏡下觀察孢子上有否長出短小芽管。若鏡檢可見厚膜孢子、假菌絲、芽管，則判斷供試品檢出白色念珠菌。3.結(jié)果判斷:供試品在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且疑似菌在念球菌顯色培養(yǎng)基平板上生長的菌落呈陽性