DB31-T 955-2022 豬圓環(huán)病毒3型實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法

代替DB31/T955—2015豬圓環(huán)病毒3型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法上海市市場(chǎng)監(jiān)督管理局IDB31/T955—2022前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4原理 1 2 28樣品采集與處理 2 310實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 附錄A(規(guī)范性)溶液配制 5附錄B(規(guī)范性)引物和探針 7 8本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件代替DB31/T955—2015《豬圓環(huán)病毒2a/2b亞型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)和分型方法》,與——增加了耗材(見(jiàn)第6章);——更改了試劑(見(jiàn)第7章，2015年版的第6章);——增加了糞便樣品采集方法(見(jiàn)第8章);——?jiǎng)h除了注意事項(xiàng)(見(jiàn)2015年版的第9章);——更改了附錄A(見(jiàn)附錄A,2015年版的第6章);—更改了DNA提取方法(見(jiàn)附錄C,2015年版的附錄A);——增加了熒光PCR反應(yīng)體系(見(jiàn)附錄D)。本文件由上海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由上海市畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——DB31/T955—2015。H1豬圓環(huán)病毒3型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法1范圍本文件規(guī)定了豬圓環(huán)病毒3型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的儀器設(shè)備、耗材、試劑、樣品采集與處理、DNA提取和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)等技術(shù)要求。本文件適用于豬圓環(huán)病毒3型核酸檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。豬圓環(huán)病毒3型porcinecircovirustype3;PCV3屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬新發(fā)豬病毒性傳染病病原，表現(xiàn)為豬皮炎與腎病綜合征的臨床病癥。開(kāi)放閱讀框openreadingframe;ORF從起始密碼子開(kāi)始，是DNA序列中具有編碼蛋白質(zhì)潛能的序列，結(jié)束于終止密碼子連續(xù)的堿基循環(huán)數(shù)閾值cyclethresholdvalue每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。根據(jù)PCV3ORF1序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。5.1熒光PCR儀。5.2研缽或組織研磨器。5.4高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃,離心力可達(dá)12000r/min以上。25.6普通冰箱：2℃~8℃。7.3DNAzol,商品化DNA抽提試劑，于2℃~8℃保存。8.1.2研缽或組織研磨器，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。38.2.1血清樣品：用真空采血管采集受檢豬靜脈血2mL,室溫或者37℃傾斜放置自然凝集20min~30min,2000r/min離心5min,吸取不少于0.5mL上清液至1.5mL無(wú)菌離心管內(nèi)備用。8.2.2全血樣品：用EDTA真空抗凝管采集受檢豬靜脈血2mL,吸取1mL全血置于1.5mL無(wú)菌離心管內(nèi)備用。8.2.3拭子樣品：用無(wú)菌棉拭子反復(fù)刮擦呼吸道黏膜5次~10次，蘸取分泌物后將棉拭子放入5mL無(wú)菌離心管中，加入2mLPBS,浸泡20min~30min,振蕩、擠干拭子，浸泡液采用4000r/min離心1min,吸取1mL上清液至1.5mL無(wú)菌離心管內(nèi)備用。8.2.4精液樣品：取解凍或新鮮精液樣品1mL至1.5mL無(wú)菌離心管中，振蕩混勻，5000r/min離心30s,吸取不少于0.5mL上清液至新的1.5mL無(wú)菌離心管內(nèi)備用。8.2.6糞便樣品：取豬新鮮糞便1g,裝入15mL無(wú)菌離心管中，加入5mLPBS,混勻。8.2.7細(xì)胞培養(yǎng)物：細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，將細(xì)胞培養(yǎng)物置于1.5mL無(wú)菌離心管中，編號(hào)備用。8.3樣品保存和運(yùn)輸依據(jù)8.1,8.2要求采集的樣品可立即用于檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的樣品，在2℃~8℃下保存應(yīng)不超過(guò)24h,-18℃及以下可以穩(wěn)定保存3個(gè)月，-70℃及以下可長(zhǎng)期保存。樣品運(yùn)送采用低溫保存進(jìn)行8.4.2組織樣品：取1g組織樣品，剪碎，加8.4.3糞便樣品：5000r/min離心10min,吸取1mL上清液至1.5mL,無(wú)菌離心管內(nèi)備用。8.4.4細(xì)胞培養(yǎng)物：4000r/min離心5min,吸取1mL上清液至1.5mL無(wú)菌離心管內(nèi)備用。DNA提取方法按附錄C執(zhí)行。在試劑配制區(qū)內(nèi)進(jìn)行。設(shè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管數(shù)為n,并宜按照n+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制，按照附錄D配制每個(gè)反應(yīng)的體系。配制反應(yīng)液在冰盒中進(jìn)行。將10.1中配制的熒光PCR反應(yīng)液充分混勻，按照每管20μL分裝于0.2mL,PCR光學(xué)反應(yīng)管中，做好標(biāo)識(shí)轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)。4在核酸提取區(qū)進(jìn)行。在每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入待檢樣本的核酸5μL,500r/min~1000r/min離心30s。在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行。將10.3離心后的PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀中，設(shè)置報(bào)告熒光為HEX,采用其他報(bào)告熒光時(shí)應(yīng)按儀器說(shuō)明設(shè)定對(duì)應(yīng)通道；淬滅熒光設(shè)定為None,校準(zhǔn)熒光設(shè)定為None。可根據(jù)不同品牌儀器說(shuō)明等效設(shè)置參數(shù)。檢測(cè)分為三個(gè)階段：a)第一階段，95℃預(yù)變性3min;c)第三階段，25℃冷卻10s。檢測(cè)結(jié)束后，保存結(jié)果，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。陽(yáng)性對(duì)照有典型S形擴(kuò)增曲線，且Ct值≤30;陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增曲線，且無(wú)Ct值或Ct值>35;兩10.5.3.1陽(yáng)性判定：被檢樣品檢測(cè)結(jié)果HEX通道Ct值≤30,且擴(kuò)增曲線為典型的S形曲線，報(bào)告為10.5.3.2陰性判定：被檢樣品檢測(cè)結(jié)果HEX通道無(wú)Ct值或Ct值>35,且無(wú)典型的S形擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PCV3核酸陰性。10.5.3.3可疑判定：被檢樣品檢測(cè)結(jié)果30<Ct值≤35,且擴(kuò)增曲線為典型的S形曲線，判定為可疑，可疑樣品重新檢測(cè)，如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍然Ct值≤35,且擴(kuò)增曲線為典型的S形曲線，報(bào)告為PCV3核酸陽(yáng)5(規(guī)范性)A.1磷酸鹽緩沖液(0.01m用800mL蒸餾水溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa?HPO?和0.24gKH?PO?。用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加蒸餾水至1L。分裝后經(jīng)121℃、20min高壓滅菌后備用。A.22×PCR酶預(yù)混液配制2×PCR酶預(yù)混液，使其熱啟動(dòng)Taq酶終濃度為160U/mL,Tris-HCl(pH8.4)終濃度為40mmol/L,KCl終濃度為100mmol/L,MgCl?終濃度為6mmol/L,dATP、dTTP、dGTP6(規(guī)范性)引物和探針引物、探針的名稱(chēng)和序列見(jiàn)表B.1。表B.1引物、探針的名稱(chēng)和序列名稱(chēng)序列PCV3-F1(上游引物)PCV3-R1(下游引物)PCV3-P1(探針)5'-HEX-TACGATAAACAACTGGACCCC7(規(guī)范性)DNA提取方法C.1在核酸提取區(qū)操作。DNA抽提使用DNAzol試劑提取，也可以使用等效商品化試劑盒提取。C.2取n個(gè)1.5mL滅菌離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行標(biāo)號(hào)。C.3每管先加入800μLDNAzol,再分別加入被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各200μL,顛倒10次混勻，2℃~8℃10000r/min離心10min。C.4取900μL上清液，置于新的1.5mL滅菌離心管中，加入500μL無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置3min,2℃~8℃10000r/min離心5min。C.5棄上清液，沿管