食品微生物 食品微生物快速檢測技術(shù)學(xué)習(xí)資料

第九章食品微生物快速檢測技術(shù)微生物檢驗標準方法的必要性和重要性

有法可依有法必依執(zhí)法必嚴違法必究

有法可依有章可循有據(jù)可查有錯必糾有洞必補對食品中的致病微生物進行監(jiān)測是國家意志的體現(xiàn)食品安全

食品政治國家執(zhí)行部門

準確、可靠的檢驗結(jié)果是正確評價和保證食品安全性的先決條件，也是國際貿(mào)易上公平交易的有力科學(xué)依據(jù)。在食品微生物檢驗領(lǐng)域中，檢驗規(guī)程規(guī)范化和分析方法標準化是檢驗結(jié)果可信性的重要保證。避免“公說公有理，婆說婆有理”；避免“仁者見仁，智者見智”第一部分國內(nèi)外的食品微生物標準檢驗體系一、術(shù)語和定義

1、標準方法：指國際、區(qū)域、國家發(fā)布的經(jīng)過嚴格確認的以及公認的方法。標準方法包括參考方法和公定方法。

（1）參考方法：指適用于特殊待驗?zāi)繕说慕?jīng)過國際或國家公認的檢驗方法。對于食品微生物檢驗而言，典型的傳統(tǒng)的參考方法是培養(yǎng)法。

（2）公定方法：指知名的技術(shù)組織或機構(gòu)（如AOAC）公布的檢測方法。

2、非標準方法：標準方法中未包含的需要確認后才能采用的方法。

可替代方法：指用來檢驗?zāi)骋惶囟óa(chǎn)品中某種目標微生物的與相應(yīng)參考方法等效的方法（ISO16140:2003），如快速檢測試劑盒和自動化系統(tǒng)。值得說明的是，并非所有的可替代方法都是標準方法。二、國內(nèi)外食品微生物檢測體系

國內(nèi)主要食品微生物檢測體系

國家標準(GB)

檢驗檢疫行業(yè)標準(SN)

衛(wèi)生行標(WS)

農(nóng)業(yè)行標(NY)

國外主要食品微生物檢測體系

國際標準化組織(ISO)

美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）(online)

美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(AOAC)

美國農(nóng)業(yè)部（USDA）(online)

加拿大健康署(HPB)(online)

美國公共衛(wèi)生協(xié)會(APHA)

北歐食品分析委員會（NMKL）

法國標準協(xié)會(AFNOR)標準、英國國家標準(BS)、日本國家標準(JIS)、韓國國家標準（KS）等

標準方法非標準方法

科學(xué)書籍和期刊公布的方法；

實驗室研發(fā)的未出版的方法；

部分由設(shè)備制造商指定的方法；

擴充和修改過的標準方法；

企業(yè)標準；

部分協(xié)會標準；

部分地方標準等。食品微生物檢測方法標準方法未包含的方法http://www.foodmate.net

食品中常規(guī)指示菌和致病菌的關(guān)系好氧菌總數(shù)腸桿菌科大腸菌群糞大腸菌群大腸桿菌沙門氏菌致瀉性大腸桿菌金黃色葡萄球菌糞鏈球菌弧菌科單增李斯特氏菌志賀氏菌芽孢桿菌O157厭氧梭菌彎曲菌常規(guī)指示菌和致病菌的“危害分類”VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenic如霍亂弧菌、O157、單核細胞增生李斯特氏菌等如腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌等如乳酸桿菌、雙歧桿菌等（二）食品微生物檢測方法方法定量方法定性方法直接計數(shù)方法細菌總數(shù)*、大腸菌群*、大腸桿菌*、腸球菌*、金黃色葡萄球菌*、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核增生李斯特氏菌、沙門氏菌、彎曲菌屬、腸桿菌科*、副溶血性弧菌、亞硫酸鹽還原梭菌、李斯特氏菌屬、霉菌和酵母菌數(shù)*、嗜冷菌*、乳酸菌、雙歧桿菌等間接計數(shù)法(MPN法)大腸菌群*、糞大腸菌群*、大腸桿菌*、腸球菌*、金黃色葡萄球菌*、蠟樣芽孢桿菌、單核增生李斯特氏菌、腸桿菌科*、副溶血性弧菌、亞硫酸鹽還原梭菌等致病菌：單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌、O157、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、肉毒梭菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、產(chǎn)毒霉菌等

帶*者通常被列為食品衛(wèi)生指示菌（三）常見微生物檢測項目常規(guī)微生物項目：細菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)致病微生物項目：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等政府檢測機構(gòu)為什么需要微生物快速檢測？日益嚴峻的食品安全局勢的需要提高檢測效率節(jié)約人力資源成本與國際接軌企業(yè)為什么需要微生物快速檢測？市場銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨。尤其是一些保質(zhì)期較短的產(chǎn)品。減少物流的壓力，盡可能減少倉存，加快資金周轉(zhuǎn)。節(jié)約人力資源成本（外資企業(yè)尤其突出）對于運行HACCP質(zhì)量保證體系的企業(yè)來說，快速檢測方法尤其重要。可以快速檢測原料及半成品的污染情況，以采取相應(yīng)的措施控制最終產(chǎn)品的微生物超標情況。快速方法勢在必行國外許多政府檢測機構(gòu)都在大量使用快速檢測方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國外應(yīng)用相當成功。國內(nèi)的許多政府檢測機構(gòu)也都已經(jīng)在使用或正在考慮使用國外先進的快速檢測技術(shù)。從長遠發(fā)展趨勢來說，快速方法是微生物檢測的一大方向。（四）常規(guī)微生物快速檢測技術(shù)現(xiàn)狀A(yù)傳統(tǒng)計數(shù)改良法：1、螺旋平板計數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計數(shù)2、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測。3、紙片法：培養(yǎng)基固體在載體上。省去制做培養(yǎng)基的時間。主要用于細菌總數(shù)檢測。4、其它：如Simplate即用膠,改良MPN產(chǎn)品。1.螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀aColyte自動菌落計數(shù)儀螺旋平板原理平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍螺旋平板法的優(yōu)缺點優(yōu)點：與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋3個梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點：檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計數(shù)儀，否則人工計數(shù)更麻煩。2.濾膜法濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。優(yōu)點：靈敏度增大，菌落無擴散情況，便于計數(shù)。缺點：需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數(shù)要求特別嚴格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。3.皿膜法—以紙片法為代表紙片法是目前被廣泛接受的方法。國標餐具大腸菌群采用的就是紙片法。優(yōu)點：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計數(shù)較方便。缺點：不能節(jié)省檢測時間。檢測成本相對偏高。大腸菌群紙片存在與MPN法無法對應(yīng)的問題，金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問題。目前僅細菌總數(shù)紙片有一些用戶。4.其它即用膠，MPN改良法Simplatecolilert主要用于水樣或澄清樣品的大腸菌群或大腸桿菌檢測常規(guī)微生物快速檢測技術(shù)現(xiàn)狀B快速檢測微生物數(shù)量的新方法：1、ATP法：目前產(chǎn)品較多，如CHARM，Biotrace,…..等。2、電化學(xué)法：Sy-Lab公司Bactrac4300，Tempo,…3、顏色變化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。4、流式細胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測量法1.表面潔凈的檢測方法微生物學(xué)法：紙片、瓊脂板、棉簽拭子、海綿拭子非微生物學(xué)法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白質(zhì),降解糖、NADP(輔酶II)，其它。ATP---三磷酸腺苷ATP來源于細菌酵母霉菌生物膜組織殘留廢棄物污染人的污染1.

人接觸設(shè)備或器具2.設(shè)備或器具被污染3.清洗不正常4.非正常的敏感物污染5.微生物污染ATP存在表明什么？檢測原理熒光素?zé)晒馑孛赶佘找涣姿嵫鹾蠠晒馑責(zé)晒釧TP法兩大用途1、用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對生產(chǎn)線和管道進行快速清潔程度檢測。政府檢測機構(gòu)用ATP方法缺乏法律依據(jù)。ATP法與微生物數(shù)量沒有必然的聯(lián)系。2、改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗。LUM－T清潔程度快速檢測PocketSwab

Plus<30

秒獲得結(jié)果取樣混合檢測LUM-T的獨特優(yōu)勢CHEF熟肉制品成熟度檢驗MicroQ水中微生物污染程度檢測Cidelite殺蟲劑殘留初篩Paslite牛奶巴氏消毒效果Somalite體細胞計數(shù)SL/MRLtest抗生素殘留檢測（連接ROSA

imager)基于ATP原理的用于成品檢測的

微生物檢測系統(tǒng)Charm

LUM-96（用于UHT產(chǎn)品）BiotraceCelsis（主要用于化妝品）Millipore公司的MicroScanCelsis和LUM-96保溫2天，檢測30分鐘（96個樣）ATP法檢測成品的優(yōu)缺點優(yōu)點：LUM-96通常用于進行商業(yè)無菌檢測?？纱蟠罂s短庫存時間，減少物流壓力和成本。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通常懷疑假陰性的可能，特別是用ATP單個檢測代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測，其風(fēng)險是一定存在的。(如保溫增菌時間不夠，菌數(shù)未達到一定數(shù)量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標致病菌未大量增菌等原因)Millipore公司最新推出的MicroStarMicroStar的原理及局限性MicroStar快速微生物檢測系統(tǒng)是結(jié)合了生物熒光、膜過濾及CCD熒光照相檢測等技術(shù)的新型檢測系統(tǒng).可過濾樣品經(jīng)膜過濾后，將菌截留在特殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增菌后取出，加ATP釋放劑，然后加熒光素和熒光素酶，顯示的熒光信號在熒光顯微鏡或熒光檢測器下觀察并計數(shù)。MicroStar的優(yōu)缺點優(yōu)點：縮短培養(yǎng)時間，提高靈敏度。適合于菌數(shù)較低的可過濾產(chǎn)品使用。缺點：儀器較昂貴，運行成本也非常貴。不能用于檢測未知的可能菌數(shù)較高的樣品(不知稀釋多少倍，因菌數(shù)必須稀釋至80個左右)。整個檢測時間還不夠快，通常需16小時以上。2.電化學(xué)方法(電導(dǎo)率法或電阻抗法)奧地利Sylab公司的Bactrac4300和Biotrac4200梅里埃公司的Bactometer和Tempo英國Multhus公司(已倒閉)英國DWS公司的Rabit……外觀比較Bactrac4300梅里埃的BactoMeterDWS公司的Rabit馬色斯120世界上最好的電化學(xué)微生物快速檢測產(chǎn)品

Bactrac4300系統(tǒng)Sy-lab—Bactrac4300常規(guī)微生物項目快速檢測技術(shù)3.顏色

MicroFoss(Biosys)微生物自動監(jiān)測儀微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化，記錄達到突變點的時間。Microfoss的特點與阻抗法類似，可以實現(xiàn)快速檢測。缺點：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。因此在我國目前還沒有用戶。梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強度。光強度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。方法較新，用戶還需要一個過程了解。4.流式激光FOSS公司

BactoScanFC牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀采用流式細胞原理。對微生物進行核酸染色，用流式細胞技術(shù)進行計數(shù)BactoScanFC的優(yōu)缺點優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)缺點：死活細胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數(shù)。美國Chemunex公司

微生物快速檢測系統(tǒng)美國Chemunex公司將流式細胞技術(shù)與活細胞熒光探針標記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。其最大的特點是只檢測活細胞數(shù)，速度極快，處理量大。與FOSS的BactoScanFC檢測死活細胞都檢測不同。是目前國際上正在認可的生物熒光定量檢測微生物數(shù)量的兩種方法之一。另一種是Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP檢測的產(chǎn)品。熒光酶標記原理

直接單細胞標記(包括孢子)

細胞無增菌要求標記在90分鐘內(nèi)完成直接對活細胞和酵母進行標記標記的細菌標記后的酵母標記后的霉菌ChemScanRDI三個簡單的步驟2.標記3.激光掃描1.過濾檢測步驟-TVC

1.過濾2.標記3.激光掃描樣品過濾預(yù)標記60min濾膜轉(zhuǎn)移ChemScanRDI

?儀器分析標記30minChemScanòRDI

主機激光掃描分析儀3分鐘分析時間結(jié)果直接顯示細胞個數(shù)LaserscanningMicroscopeConfirmationClientPortfolio-Pharmaceutical-USA-USA-USA-USA-USA-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-JAPAN-JAPAN-JAPAN-JAPANJOHNSON&JOHNSON(M)MERCK(M)BAUSCH&LombALCONLONZAWYETHNOVARTIS(M)ASTRAZENECAPARKEDAVISPFIZERINSTITUTPASTEURAVENTISROCHE(M)SANOFI(M)SMITH&NEPHEWGLAXOSMITHKLINE(M)SERONODAIICHITORIIFUJISAWACHUGAI……(M)=multi-siteinstallation140ChemScansystemsinstalled

DRINKINGWATERAGBARAnglianWater,Ondeo,ThamesWater,Vivendi,Dordmund,Tokyo,…SEMICONDUCTORSIBM,Siemens,TI,…流式細胞計數(shù)技術(shù)

用于非過濾產(chǎn)品流式細胞:

線性流體

單細胞分析

靈敏的檢測頭Bactiflow適合實驗室或研究用日處理量不大于40個樣品D－Count適合實驗室或生產(chǎn)現(xiàn)場使用，日處理量大于40個樣品的場合標記和檢測原理EnzymeViabilitysubstrateFreefluorochromeMicro-organismDetectorDetectorLaserFlowCell細胞標記12minutes細胞計數(shù)1minute自動吸樣

無需預(yù)處理

每批可做64個樣，含陰性和陽性質(zhì)控最小的人力要求全自動標記和過濾

加所有要求的標記試劑

控制溫育時間和溫度

去除大的顆粒(25μm尼龍網(wǎng)過濾)快速敏感的分析

每小時50個樣品

直接按個/mL顯示結(jié)果數(shù)據(jù)處理區(qū)分微生物和顆粒的功能強大產(chǎn)品應(yīng)用范圍廣增強靈敏度直接顯示細胞數(shù)無需數(shù)據(jù)解釋直觀易讀完整的數(shù)據(jù)追溯性易于確證三種型號的差異√√哪些類型客戶可以使用？大型食品、化妝品、藥品企業(yè)，對快速檢測速度及樣品處理量要求高。目前儀器非常貴，運作成本與免疫法相似。C致病菌快速檢測方法顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。市場上的產(chǎn)品多，如BioMeriux,Tecra,Neogen,Biocontrol,Matrix等。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主?；蛐酒貉芯繜狳c。致病微生物快速檢測產(chǎn)品免疫磁分離法—Matrix公司的Pathatrix致病菌快速檢測系統(tǒng)ELISA方法—澳洲TECRA公司的免疫捕獲快速檢測分子生物學(xué)方法(基因探針及PCR方法)GLISA---膠體金免疫層析致病菌快速檢測條熒光酶免—Vidas系列產(chǎn)品(略)顯色培養(yǎng)基–法國AES公司GLISA－膠體金免疫層析檢測條氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。膠體金檢測條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡便。關(guān)鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水紙層析條上固定。膠體金微生物檢測條在國內(nèi)已經(jīng)有不少產(chǎn)品，但用戶并不多，主要是質(zhì)量不穩(wěn)定。外來的膠體金微生物檢測產(chǎn)品比較多。常見的膠體金檢測條舉例大腸桿菌O157李斯特氏菌沙門氏菌膠體金檢測條的優(yōu)缺點膠體金檢測方法屬于免疫檢測法，檢測的是死菌和活菌。一般需要增菌過夜。增菌后的檢測非常簡單，約10分鐘一般能完成。無需專門的檢測儀器。進口的檢測條的價格比較高，通常要30－90元。分子生物學(xué)方法基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结樂ㄒ话阋残枰鼍?，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。分子生物學(xué)方法應(yīng)用前景試劑盒開發(fā)相對比較容易。只要找出特征的基因片斷，合成出引物即可。目前客戶比較關(guān)注的致病菌，包括沙門氏、李斯特氏、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCR試劑盒供應(yīng)。常見的基因探針方法或儀器BAXGene-trakGen-probeVermicon……基因芯片-DNA點樣儀

基因芯片的基本技術(shù)路線1、采用數(shù)據(jù)庫中各種微生物的全基因組序列資料或部分基因組序列資料，通過生物信息學(xué)方法找出各種微生物的特異序列，每個檢測目標找3-5個特異序列，每個序列長度為25-75mer。并設(shè)計五條陰性序列（這些序列不代表任何一個待分析的微生物）。2、合成上述特異序列（探針）。探針將不是傳統(tǒng)的cDNA形式，而是oligo寡聚核酸，這樣將大大提高檢測靈敏度。3、利用基因芯片點樣系統(tǒng)將探針點樣到載體上。同一種微生物的特異性探針點樣到芯片的一個區(qū)域。4、尋找適當?shù)姆椒?，提取微生物的基因組核酸。5、加入相應(yīng)的引物、熒光染料或用分子信標的方法，通過PCR擴增特異性片段。6、將帶有熒光染料標記的核酸與基因芯片雜交。7、雜交結(jié)果由基因芯片掃描儀進行掃描判讀，對于管帽芯片也可用熒光顯微鏡進行觀察。8、結(jié)果分析，針對雜交陽性位點，找出對應(yīng)的陽性樣品。

SN/T1543:2005食源性致病菌基因芯片鑒定方法分子生物學(xué)方法病原菌檢測系統(tǒng)的優(yōu)缺點分子生物學(xué)方法檢測致病菌，特異性較強，技術(shù)較為前沿，特別是相對國標方面來說。但國外用戶反映其假陽性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過AOAC的認證。只有最適合，沒有最好!第二部分微生物快速檢測系統(tǒng)的局限性

大部分快速方法適用于檢測單一微生物，適用于質(zhì)量控制程序中快速篩選大量食品樣品中所存在的特殊病原體或毒素。然而，快速檢驗方法所得陽性者，僅僅是可疑，必須用標準參考方法予以證實，雖然證實試驗需要幾天，但不能予以限制。

快速檢驗方法的評估結(jié)果表明，其對于某類食品的性能優(yōu)于其它食品，很大程度上是由于食品成分干擾所致，有些食品成分對于快速方法中所應(yīng)用的技術(shù)是比較麻煩的。例如，每一食品成分可能抑制DNA雜交或Taq聚合酶，但對抗原-抗體相互作用沒有影響，反之亦然。既然方法的靈敏度、特異性和精確性依賴于待驗食品，那么進行比較研究以確保某一特殊檢驗方法能有效分析此類食品是明智的。

基于DNA檢驗方法的特異性通過短的探針來顯示，因此用特殊探針或引物檢測毒素基因，陽性結(jié)果僅僅表明某細菌具有該基因序列，以及某細菌可能是產(chǎn)毒的，不能從客觀上說明該基因得以表達，并產(chǎn)生毒素，例如在梭菌和葡萄球菌中毒病例中，DNA雜交和PCR僅能檢測到基因的存在，但不能用來檢測預(yù)先形成的毒素是否存在。

隨著某一快速方法更加頻繁的使用，其好處和局限性同時變得更加明顯。使用者在選擇和徹底評估這些快速方法時，必須保持謹慎。FDA認可使用的檢測系統(tǒng)和試劑盒

檢測和鑒定食源性病原菌的微量生化復(fù)合試劑盒

微生物自動鑒定系統(tǒng)

核酸雜交分析（分子生物學(xué)）方法

免疫學(xué)分析方法

其它商品化快速檢測方法和培養(yǎng)基微生物快速檢測系統(tǒng)的認可一、USDAFDA認可情況第三部分方法的選擇1．客戶要求；2．方法的準確性；3．方法的特異性；4．方法的實用性；5．方法的穩(wěn)定性；6．方法的靈敏度；7．方法的檢測限和測量限；8．實驗室硬件條件（儀器、設(shè)備、場地設(shè)施、人員資質(zhì)等）；9．商業(yè)快速檢測系統(tǒng)的供應(yīng)保證、價格、認可程度和售后服務(wù)。

通常情況下，實驗室應(yīng)采用滿足客戶（注：對于企業(yè)實驗室，其所在單位為其內(nèi)部客戶）需要并適用于所進行的檢測的方法，包括在抽樣的方法。應(yīng)優(yōu)先使用以國際、區(qū)域或國家標準發(fā)布的方法。當認為客戶提出的方法不合適或已過期時，實驗室應(yīng)通知客戶。

當客戶未指定所用方法時，除優(yōu)先使用國際、區(qū)域、國家或知名的技術(shù)組織發(fā)布的標準方法外，還可選擇非標準方法，但必須對所選擇的非標準方法進行嚴格驗證、確認和審批，如能滿足實驗室的預(yù)期用途，并經(jīng)客戶同意，也可使用。第四部分微生物檢驗方法的編寫標準方法的一般構(gòu)成和編寫順序：

1．資料性技術(shù)要素：封面、目次*、前言、引言；

2．規(guī)范性一般要素：名稱、范圍、規(guī)范性引用文件*；

3．規(guī)范性技術(shù)要素：術(shù)語和定義*、符號和縮略語、食品微生物檢驗(原理*、培養(yǎng)基和試劑、設(shè)備和材料、采樣*、制樣、增菌培養(yǎng)、篩選、鑒定和確認等)、結(jié)果判定（判定方法和判定標準）、結(jié)果報告*、規(guī)范性附錄*；

4．資料性補充要素：資料性附錄*、參考文獻*、索引*。

上述構(gòu)成要素不是任何一項標準都需要全部包括的，標有*者可根據(jù)標準化對象的特征和制定標準化的目的而取舍。第一節(jié)標準方法的編寫第二節(jié)非標準方法的編寫

一般要求以接近國家標準（如GB/T1.1－2000）或行業(yè)標準推薦方法的格式進行編寫。等同、修改采用國際標準或國外先進標準時，其編寫格式和方法可與被采用的標準一致。力求標準結(jié)構(gòu)嚴謹、層次分明、主題突出，簡單易懂。一、非標準方法的編寫原則

二、非標準食品微生物學(xué)檢驗方法的基本編寫格式（1）封面每項非標準微生物檢驗方法應(yīng)該有封面，封面的內(nèi)容有“×××（單位）×××（部門）非標準方法”字樣和非標準方法的標志（注：選擇性的）、中文名稱、英文名稱（注：選擇性的）、非標準方法的唯一性編號、代替非標準編號（注：選擇性的）、發(fā)布日期、實施日期、標準的審批部門等。（2）正文內(nèi)容一般包含下列內(nèi)容，必要時可增減相關(guān)條目：①目的、范圍；②方法提要或原理:簡述所用方法的主要步驟及采用的基本原理；③設(shè)備和材料：標明規(guī)格和型號；④培養(yǎng)基和試劑：必須符合GB/T4789.28和SN/T1583的規(guī)定；⑤檢驗程序：畫出主要的檢驗程序框圖；⑥操作步驟：包括試樣制備（含稀釋或按特定條件的制備）、培養(yǎng)（含前增菌培養(yǎng)和增菌培養(yǎng)，分離培養(yǎng)等，可根據(jù)需要取舍和分步描述）、初步鑒定（可根據(jù)需要取舍）、確證鑒定（含進一步的生化反應(yīng)和血清學(xué)分型，可根據(jù)需要確定試驗內(nèi)容）毒素試驗（可根據(jù)需要取舍）、動物試驗（可根據(jù)需要取舍）；⑦結(jié)果報告；⑧其它（包括內(nèi)部質(zhì)量保證要點、生物防護要求；）；⑨附錄（資料性附錄和規(guī)范性附錄）⑩方法來源（如參考文獻、儀器設(shè)備方法等）。三、非標準方法的審批

制訂SOP，實施需要其它材料？進一步規(guī)范方法實驗室將全部材料送至主管部門實驗室提供材料和信息審核全部材料被批準和備案否實驗室申請認可，提交材料是是否需要采取后續(xù)措施（包括能力驗證、實驗室內(nèi)試驗、實驗室間協(xié)作試驗等）？實驗室編寫和確認方法實驗室采取所需的措施主管部門組織技術(shù)專家組進行材料審查和技術(shù)審核（包括能力驗證結(jié)果、性能特征、實驗室內(nèi)試驗結(jié)果、實驗室間協(xié)作試驗結(jié)果等），決定是否需要現(xiàn)場考查?，F(xiàn)場核查實驗室調(diào)研現(xiàn)場核查？否專家組評估所采取措施是否充分合理？是否是是否

非標準食品微生物學(xué)檢驗方法的審批程序第三節(jié)標準操作程序的編寫標準操作程序（standardoperationpractices，SOP）是用來指導(dǎo)某個具體過程、事物所形成的技術(shù)性細節(jié)描述的可操作性文件，國內(nèi)常常稱之為“作業(yè)指導(dǎo)書”，二者沒有本質(zhì)區(qū)別。SOPs的編寫及使用是實驗室成功質(zhì)量體系中的一部分，因為它能為操作人員提供正確完成一項工作的信息，從而保證不同操作人員都能在一定的不確定度范圍內(nèi)得到相同的微生物檢驗結(jié)果。實驗室應(yīng)關(guān)注以下四個方面SOPs：1．方法類：包括食品微生物檢驗方法中不詳細或不完善部分的補充，期間核查、方法確認及比對等；2．設(shè)備類：重要或復(fù)雜設(shè)備的使用、操作規(guī)范（如設(shè)備制造商提供的技術(shù)說明書不夠明細等）；3．樣品類：取樣、制樣和樣品處置的“實施細則”等；4．數(shù)據(jù)類：定量檢測結(jié)果的表達、異常數(shù)據(jù)的剔除、測量結(jié)果不確定度的評定等等。SOP是技術(shù)性的文件，并不要求必須制訂。一、定義和分類二、食品微生物檢驗SOP的編寫依據(jù)目前，在國內(nèi)，尚未檢索到關(guān)于食品微生物檢驗SOP的編寫導(dǎo)則及相關(guān)要求；在國外，美國環(huán)境保護署(EPA)(/quality/sops.html)和美國農(nóng)業(yè)部銷售司(AMS)(/science/mpo/)均發(fā)布關(guān)于微生物檢驗SOP的編寫導(dǎo)則及相關(guān)要求，前者是后者的藍本：①EPAQA/G-6《GuidanceforPreparingStandardOperatingProcedures(SOPs)》；②EPASOPADM-02-02《StandardOperatingProcedureforPreparationandReviewofStandardOperatingProcedures(SOPs)》；③USDAMDP-ADMIN-07《PreparationandMaintenanceofStandardOperatingProcedures(SOPs)》。以上文本均可從相應(yīng)網(wǎng)站免費下載，同時EPA和USDAAMS制定了一系列與微生物檢驗相關(guān)的SOPs，這些SOPs的編寫結(jié)構(gòu)和格式值得借鑒和參考。

SOP的格式方法一：參照美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)銷售司(AMS)的微生物數(shù)據(jù)程序/science/mpo/sops.htm

方法二：參照美國環(huán)境保護署（EPA）的EPAQUALITYSYSTEM

/quality/sops.html作業(yè)指導(dǎo)書與SOP無本質(zhì)區(qū)別三、SOP的基本編寫格式

下面結(jié)合一個實例，介紹一下編寫微生物檢驗SOP的基本格式和要求：（1）封面①編寫單位：中英文對照。②標題：測定對象—測定項目—測定方法名稱(中英文對照)；測定對象：以產(chǎn)品為主，采用最常規(guī)的產(chǎn)品名稱（可參照國際、國家或行業(yè)的產(chǎn)品標準）；測定項目：應(yīng)寫明具體被測項目；當被測項目為多項時，應(yīng)一一列出，超過8項時，可只寫出前3個項目。③編寫人及時間：為保證SOP內(nèi)容的全面性和準確性，由實驗室內(nèi)具有一定資質(zhì)的使用者編寫；④審核人及時間；⑤批準人及時間：批準人一般為實驗室的技術(shù)負責(zé)人；⑥文件編號：唯一編碼；⑦受控狀態(tài)：是否受控；⑧修訂號：第×××次修訂；⑨發(fā)放序號。（2）正文內(nèi)容一般包含下列內(nèi)容，必要時可增減相關(guān)條目：①目的；②范圍；③方法提要或原理:簡述所用方法的主要步驟及采用的基本原理；④程序提綱：包括培養(yǎng)基和血清、設(shè)備和玻璃器皿、取樣、測試樣品的制備、測試樣品和最初懸浮液、非選擇性前增菌、選擇性增菌、篩選、可疑典型菌落的分離和純化、生化鑒定、血清學(xué)確認和血清型、確認；⑤安全性；⑥質(zhì)量保證；⑦參考文獻；⑧特殊程序：與④對應(yīng)；⑨結(jié)果表達和測試報告；⑩附錄（資料性附錄和規(guī)范性附錄）。第五部分食品微生物檢驗方法的驗證和確認

一個實驗室擬用某一食品微生物檢驗方法前，無論是標準方法還是非標準方法，皆應(yīng)對其進行嚴格驗證或確認。詳見《食品微生物實驗室質(zhì)量管理手冊》第一節(jié)驗證和確認導(dǎo)則

在《GB/T19000：2000質(zhì)量管理體系基礎(chǔ)和術(shù)語》中，驗證被定義為“通過提供客觀證據(jù)對規(guī)定要求已得到滿足的認定”，確認被定義為“通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認定”。在ISO/IEC17025中中,確認被定義為“通過核查并提供客觀證據(jù)，以證實某一特定預(yù)期用途的特殊要求得到滿足”。從以上定義可以看出，驗證要保證“做得正確”，而確認則要保證“做的東西正確”。驗證注重“過程”，確認注重“結(jié)果”。一、概念二、微生物檢驗方法驗證和確認的依據(jù)

①美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)，執(zhí)行標準為：“AOACInternationalMethodsCommmitteeGuidelinesforValidationofQualitativeandQuantitativeFoodMicrobiologicalOfficialMethodsofAnlysis-2002”；②國際標準化組織(ISO)，執(zhí)行標準為：ISO/TR13843：2000《Waterquality--Guidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods》和ISO16140:2003《Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs--Protocolforthevalidationofalternativemethods》；③NordVal：NV-DOC.D–2005-01-01《Protocolforthevalidationofalternativemicrobiologicalmethods》；④新加坡認可委員會(SAC)：C&BandENV002

《MethodValidationofMicrobiologicalMethods》。此外，可參考GB/T18510-2001《煤和焦炭試驗可替代方法確認準則》。三、驗證和確認試驗技術(shù)

用于驗證和確認食品微生物檢驗方法性能的試驗技術(shù)包括：①使用參考菌株進行核實；②與其他方法所得的結(jié)果進行比較；③實驗室間比對；④對影響結(jié)果的因素作系統(tǒng)性評審；⑤根據(jù)對方法的理論原理和實踐經(jīng)驗的科學(xué)理解，對所得結(jié)果不確定度進行評定。以上驗證和確認食品微生物檢驗方法性能的試驗技術(shù)，可概略分為兩大類：實驗室間驗證/確認試驗（協(xié)作試驗）和實驗室內(nèi)驗證/確認試驗（單一試驗）。

實驗室間驗證/確認試驗是指在若干實驗室內(nèi)由不同操作者進行的驗證/確認試驗，而實驗室內(nèi)確認試驗是僅在特定的實驗室內(nèi)進行的驗證/確認試驗。四、對試驗人員的要求驗證和確認食品微生物檢驗方法的人員,必須符合以下要求：

A掌握方法中試樣處理的原理；

B掌握方法中食品成分對微生物的干擾以及微生物的增菌原理；

C掌握方法中目標微生物分離、純化、鑒定和確認的原理；

D對儀器的構(gòu)造要有基本了