T-WEBIO 0002-2024 人呼吸道合胞病毒實時熒光RT-PCR 檢測方法

ICS07.100.01CCSC50法Real-timefluorescentRT-PCRdetectionmethodforhumanrespiratorysyIT/WEBIO0002—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4縮略語 5生物安全要求 6防污染要求 27主要儀器 28主要試劑 29檢測程序 210結果判斷 4附錄A（資料性）操作流程示意圖 6T/WEBIO0002—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利，本標準的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本文件由中國科學院武漢病毒研究所提出。本文件由武漢東湖國家自主創(chuàng)新示范區(qū)生物醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會歸口。本文件起草單位：中國科學院武漢病毒研究所、湖北省婦幼保健院、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院、中華人民共和國廣州海關技術中心、湖北省疾病預防控制中心。本文件主要起草人：鄧菲、楊娟、蘇正元、付杰、白源、張丹娜、沈姝、唐霜、吳春晨、鄭昕、師永霞、徐軍強、李翔、殷強玲。1T/WEBIO0002—2024人呼吸道合胞病毒實時熒光RT-PCR檢測方法本文件規(guī)定了人呼吸道合胞病毒實時熒光RT-PCR檢測的術語和定義、縮略語、生物安全要求、防污染要求、主要儀器、主要試劑、檢測程序、結果判斷。本文件適用于臨床樣本咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、誘導痰液、支氣管沖洗液、肺泡灌洗液和病毒培養(yǎng)物中的人呼吸道合胞病毒實時熒光RT-PCR的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T42066急性病毒性感染呼吸道樣本采集WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈反應(PCR)技術的應用WS/T442臨床實驗室生物安全指南國衛(wèi)科教發(fā)〔2023〕24號人間傳染的病原微生物目錄3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1人呼吸道合胞病毒humanrespiratorysyncytialvirus，HRSV3.2實時熒光聚合酶鏈反應real-timefluorescencepolymerasechainreaction，real-timePCR在PCR反應體系中引入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過連續(xù)監(jiān)測繪制反應動力曲線，從而對樣本中被擴增模板DNA的初始含量進行計算。該技術包含定性和定量檢測，本標準為定性檢測。3.3反轉錄reversetranscription，RT以RNA單鏈為模板，在反轉錄酶催化下合成互補DNA（即cDNA）的過程。4縮略語下列縮略語適用于本文件。HRSV：人呼吸道合胞病毒（Humanrespiratorysyncytialvirus）PCR：聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction）RT-PCR：逆轉錄聚合酶鏈反應（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）FAM：6-羧基熒光素（6-carboxyfiuorescein）Ct值：循環(huán)閾值（Cyclethreshold）ddH2O：雙蒸水（Doubledistilledwater）BSL-1：生物安全一級實驗室（Bio-SafetyLevel1）BSL-2：生物安全二級實驗室（Bio-SafetyLevel2）5生物安全要求2T/WEBIO0002—20245.1根據(jù)《人間傳染的病原微生物目錄》規(guī)定，人呼吸道合胞病毒培養(yǎng)、未經培養(yǎng)的感染材料的操作應在BSL-2進行。5.2根據(jù)《人間傳染的病原微生物目錄》規(guī)定，滅活材料的操作、無感染性材料的操作可在BSL-1進5.3臨床實驗室應按WS/T442要求進行風險評估。6防污染要求6.1實驗室廢棄物按照GB19489處理。6.2PCR防污染措施按WS/T230規(guī)定的要求進行。7主要儀器7.1熒光定量PCR儀。7.2二級生物安全柜。7.3超凈工作臺。7.4冰箱（4℃、-20℃、-70℃)。7.5高速冷凍離心機（最高離心力達12000g以上）。7.7渦旋儀。7.8高壓滅菌器。7.9核酸提取儀。8主要試劑8.1核酸提取試劑。8.2實時熒光RT-PCR試劑。8.3引物探針。針對N蛋白，設計引物探針序列如下：RSV-qF5’-GATGCWAATCATAAATTCACWGG-3’RSV-qR5’-GTATYTTTATRGTGTCTTCYCTTCC-3’RSV-P5’-FAM-TAGGTATGYTATATGCTATGTCYAGRTT-BHQ1-3’注：引物探針序列中簡并堿基W代表A/T，Y代表C/T，R代表A/G。9檢測程序檢測流程參照附錄A執(zhí)行。9.1樣本采集樣本類型包括臨床樣本咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、誘導痰液、支氣管沖洗液、肺泡灌洗液和病毒培養(yǎng)物。樣本采集所采用的器材，包括采集容器和拭子應為無菌、無DNase/RNase、一次性，所用材質與所含添加物不可抑制或干擾PCR檢測過程。采集、保存及運輸應符合GB/T42066的相關要求。9.1.1咽拭子用拭子適度用力擦拭雙側扁桃體及咽后壁，反復擦拭3次～5次，取出拭子時應避免觸及舌部。將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。9.1.2鼻咽拭子將采樣拭子垂直于鼻子(面部)方向插入鼻腔，使之與上顎平行，將采樣拭子在鼻咽部位停留15同時輕柔旋轉2次～5次，邊旋轉邊抽出采樣拭子。3T/WEBIO0002—20249.1.3鼻咽抽取物或呼吸道抽取物用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取黏液或從氣管抽取呼吸道分泌物。9.1.4深咳痰液要求病人無菌生理鹽水漱口后深咳痰液，將咳出的痰液收集于含3mL采樣液的采樣管中。9.1.5誘導痰液誘導前5min給予200μg～400μg沙丁胺醇吸入。樣本提供者在清水漱口、擤鼻后用3%的高滲鹽水超聲霧化吸入。霧化過程中，每隔10min停止霧化，囑樣本提供者在清水漱口、擤鼻后，用力咳嗽，把所有口腔內容物吐到樣本容器中。9.1.6支氣管沖洗液將收集器頭部從氣管內導管插入氣管，注入5mL生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的黏液，并用采樣液沖洗收集器1次。9.1.7肺泡灌洗液在灌洗的肺段經活檢孔注入2%利多卡因1mL～2mL，做灌洗肺段局部麻醉。將支氣管鏡頂端緊密楔入目標氣管段或亞段支氣管開口處。經操作孔道快速注入滅菌生理鹽水（室溫或37℃預熱），每次注入20mL～50mL，立即用6.6kPa～13.3kPa(50mmHg~100mmHg)負壓吸引回收灌洗液，總量60mL~120mL。9.1.8病毒培養(yǎng)物細胞來源的培養(yǎng)物，5000rpm離心5分鐘，取上清；動物來源的培養(yǎng)物，將組織制備成適當大小的塊狀，4000rpm研磨10s，間隔10s重復3次，最后5000rpm，4℃條件下離心5min，取上清。9.2樣本的運送和保存9.2.1樣本采集后應存放在2℃~8℃的條件下，48h內運送至實驗室，如暫時不進行檢測，應置于-70℃或以下溫度保存，樣本避免反復凍融。9.2.2痰液樣本應先加入2mL蛋白酶K（1g/L），在55℃下孵育15min進行液化。采集的樣本置于渦旋儀混勻，4000rpm離心5min后取200μL上清進行核酸提取。9.3核酸提取9.3.1柱提法（以TakaraMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit（9766）為例），操作步驟如下：a)吸取20μLProteinaseK和1.0μLCarrierRNA到1.5mL無菌Eppendorf離心管中；b)加入200μL樣本（平衡到室溫）到上述離心管中；c)加入200μLVGB到上述離心管中，回旋振蕩15s；d)56℃孵育10min；e)加200μL乙醇（96～100到離心管中，蓋上離心管帽，回旋振蕩15s；f)從離心管中吸取溶液（700μL/次）至SpinColumn中，注意不要滴到柱子邊緣上，蓋上離心管帽，12000rpm離心1min，棄濾液；g)重復步驟f直至所有溶液均經吸附柱SpinColumn處理；h)將吸附柱套到新套管中，加500μLBufferRWA至SpinColumn中，蓋上離心管帽，12000rpm離心1min，用移液器把吸附柱套管中的濾液吸出棄掉，將套管套回原吸附柱中；i)加700μLBufferRWB至SpinColumn中，蓋上離心管帽，12000rpm離心1min，用移液器把吸附柱套管中的濾液吸出棄掉，請沿SpinColumn管壁四周加入BufferRWB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份；j)重復步驟i；k)將SpinColumn安置于CollectionTube上，12000rpm離心2min；4T/WEBIO0002—2024l)將吸附柱放入一個新的1.5mL無RNA酶離心管中，打開柱子帽，加入50μLRNasefreeddH2O，蓋上蓋子，在室溫孵育5min，12000rpm離心1min；m)提取的RNA模板可立即進行熒光定量PCR檢測，剩余RNA分裝后貯存于-70℃以下備復檢。9.3.2人呼吸道合胞病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取試劑及方法：如采用自動化核酸提取儀和配套核酸提取試劑進行核酸提??；推薦柱提法。9.3.3提取的核酸應及時進行實時熒光RT-PCR檢測，或-70℃保存同時避免反復凍融。9.4核酸檢測9.4.1實時熒光RT-PCR反應體系配置9.4.1.1在PCR體系配制區(qū)，參照各檢測試劑盒說明書配制PCR體系，以TakaraOneStepPrimeScript?RT-PCRKit（RR064A）試劑盒為例，反應體系詳見表1；根據(jù)待檢樣本數(shù)量計算各成分體積，按順序足量加入各反應成分，并充分混勻，分裝至PCR管或板，每管或孔20μL；瞬時離心后，轉移至樣本處理區(qū)。9.4.1.2在已分裝有PCR反應混合液的PCR管或孔中分別加入提取好的樣品核酸5μL，蓋上管蓋，混勻后瞬時離心，將PCR管放入熒光PCR檢測儀內，記錄樣本放置順序。表1人呼吸道合胞病毒實時熒光RT-PCR檢測反應體系試劑使用量(μL）終濃度2×OneStepRT-PCRBufferⅢPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5TaKaRaExTaqHS（5U/μL）0.5RSV-qF（20μM）0.25RSV-qR（20μM）0.25RSV-P（20μM）0.5樣品核酸5RNaseFreeddH2O5.5Total259.4.1.3反應體系中同時設置陽性對照、陰性對照，陽性對照為含有呼吸道合胞病毒核酸的參考品，陰性對照為不含呼吸道合胞病毒核酸的樣本。9.4.2擴增程序dye）設定為None，可根據(jù)不同品牌儀器說明等效設置參數(shù)。9.4.2.2以BioRadCFX96-Touch為例，反應參數(shù)設置如下：42℃/15min；95℃/1min；95℃/10s，52℃/1min，45個循環(huán)；在每次循環(huán)的52℃退火延伸時收集熒光。試驗結束后，根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結果。9.4.2.3不同熒光PCR儀性能差異，可根據(jù)情況適當調整PCR循環(huán)的溫度和時間。10結果判斷10.1基線和閾值設置閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照的檢測熒光曲線的最高點，也可根據(jù)儀器噪音情況適當調整。5T/WEBIO0002—202410.2質控標準陰性對照無擴增曲線及Ct值，同時陽性對照Ct值≤30，且有明顯的擴增曲線，否則檢測無效。10.3結果描述及判定10.3.1被檢樣本無Ct值，且無擴增曲線，判定為呼吸道合胞病毒核酸實時熒光RT-PCR陰性。10.3.2被檢樣本Ct值不大于37，且有明顯的擴增曲線，則判定為呼吸道合胞病毒核酸實時熒光RT-PCR陽性。10.3.3被檢樣本Ct值介于37和45之間時，需重復檢測一次，如復測后Ct值仍介于37和45之間，且有明顯的對數(shù)增長期，則判定呼吸