生物化學(xué) 第五節(jié) 酶的分離提純及活性測(cè)定

第五節(jié)

酶的分離提純及活性測(cè)定一、酶的分離提純

生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類(lèi)：胞內(nèi)酶和胞外酶。酶有它一定的作用部位，一旦紊亂就導(dǎo)致疾病，如胞內(nèi)酶GDT，胞外酶胰蛋白酶所引起的后果。

胞內(nèi)酶和胞外酶胞內(nèi)酶：在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行。如糖酵解酶類(lèi)在細(xì)胞質(zhì)中，氧化還原酶在線粒體上。胞外酶：由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進(jìn)行作用的酶。這類(lèi)酶大都是水解酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶就是由胃黏膜細(xì)胞和胰腺細(xì)胞所分泌。（一）、酶的抽提破碎細(xì)胞膜：胞外酶不必破碎細(xì)胞，只需用水或緩沖液浸泡，濾去不溶物，就可得到粗抽提液。而胞內(nèi)酶則需用機(jī)械破碎法、反復(fù)凍融法、超聲波法、滲透壓法、酶法等方法來(lái)使細(xì)胞膜破裂才能釋放出來(lái)。抽提：讓酶蛋白溶于稀鹽、稀酸或稀堿等溶液，得到抽提液。（二）、純化根據(jù)酶的蛋白質(zhì)特性，用提純蛋白質(zhì)的方法如鹽析，乙醇沉淀等得到酶蛋白。二、酶活力測(cè)定1.概念

酶活力(enzymeactivity)

，也稱為酶活性。是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。 酶活力的大小可以用在一定條件下，它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來(lái)表示，即酶催化的反應(yīng)速度越快，酶的活力就越高。反之則越低。所以測(cè)定酶的活力(實(shí)際上就是酶的定量測(cè)定)就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速度。2.酶促反應(yīng)速度的測(cè)定

酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)，單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。單位：濃度/單位時(shí)間。

反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶促反應(yīng)速度逐漸下降。引起下降的因素很多，如底物濃度的降低、酶在一定的pH條件下部分失活、產(chǎn)物對(duì)酶的抑制、產(chǎn)物濃度的增加加速逆反應(yīng)的進(jìn)行等等。 因此，研究酶的速度應(yīng)以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)。這時(shí)上述各種干擾因素尚未起作用，速度保持恒定不變。

3.酶的活力單位(U，activeunit)

1961年，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議規(guī)定：1個(gè)酶活力國(guó)際單位(InternationalUnit，IU)指在特定條件下，1分鐘內(nèi)生成1μmol產(chǎn)物的酶量(或轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量)。特定條件：溫度25℃，其他條件(如pH、底物濃度等)均采用最適條件。

1972年，EC又推薦了1個(gè)新的酶活力國(guó)際單位Katal(Kat)。1Kat定義為：在最適條件下，每秒鐘可使1mol底物轉(zhuǎn)化的酶量。1Kat=6×107IU。

對(duì)酶活力進(jìn)行比較時(shí)，要采用相同的條件，相同的單位。4.酶的比活力(specificactivity)比活力的大小，即每mg蛋白所具有的酶活力。一般用單位/mg蛋白來(lái)表示，有時(shí)也用每g或每ml酶制劑含有多少個(gè)活力單位來(lái)表示。比活力是酶純度的指標(biāo)，對(duì)同一種酶來(lái)說(shuō)，比活力越高，表示酶越純