體外化學(xué)法皮膚變態(tài)反應(yīng) 動(dòng)力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)方法

體外化學(xué)法皮膚變態(tài)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)InChemicoSkinSensitisation:KineticDirectPeptideReactivityAssay（kDPRA）1范圍本方法規(guī)定了動(dòng)力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)的基本原則要求和方法。本方法用于化妝品用原料的安全性毒理學(xué)檢測(cè)，適用于單一成分物質(zhì)、已知成分及含量的多成分物質(zhì)和混合物的潛在皮膚致敏性評(píng)價(jià)。2試驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)化妝品用化學(xué)原料是否具有潛在的皮膚致敏性。3定義3.1多肽消耗百分比PercentPeptideDepletion與溶劑對(duì)照相比，受試物消耗多肽的程度。3.2單一成分物質(zhì)Mono-constituentsubstance一種主要成分含量至少為80%（w/w）的物質(zhì)。3.3多成分物質(zhì)Multi-constituentsubstance含有兩種或兩種以上的主要成分，每種主要成分的含量≥10%（w/w）和<80%（w/w）的物質(zhì)。多成分物質(zhì)是制造過(guò)程產(chǎn)生的。3.4混合物Mixture由兩種或兩種以上不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)組成的固體或液體物質(zhì)。4試驗(yàn)原理試驗(yàn)基本原理同直接多肽試驗(yàn)（DPRA），有致敏性的受試物與多肽模擬的皮膚蛋白（本試驗(yàn)僅使用半胱氨酸多肽）共同孵育，導(dǎo)致多肽量減少。不同于DPRA僅測(cè)試化學(xué)物質(zhì)一個(gè)濃度和一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，kDPRA以時(shí)間和濃度依賴(lài)的方式量化評(píng)價(jià)被測(cè)物質(zhì)的多肽結(jié)合反應(yīng)性。被測(cè)物質(zhì)采用5個(gè)濃度與半胱氨酸多肽溶液孵育不同時(shí)間（6個(gè)時(shí)間點(diǎn)）后，通過(guò)添加單溴二胺（Monobromobimane,mBrB，CAS74235-78-2）與未結(jié)合的半胱氨酸多肽形成熒光復(fù)合物，來(lái)測(cè)量多肽的剩余量。如某時(shí)間點(diǎn)未結(jié)合多肽百分比的自然對(duì)數(shù)與受試物濃度呈線性關(guān)系（準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)），則通過(guò)斜率絕對(duì)值求得反應(yīng)速率常數(shù)k，換算成對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)kt（單位：M-1s-1），并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)lgkt，以其中最大值lgkmax進(jìn)行結(jié)果判斷評(píng)價(jià)受試物的皮膚致敏性。5試劑和受試物制備5.1多肽片段與純度半胱氨酸多肽：Ac-RFAACAA-COOH，分子量：751.35，純度：≥95%。5.2陽(yáng)性對(duì)照物陽(yáng)性對(duì)照采用肉桂醛（CAS104-55-2；純度≥95%）。5.3受試物5.3.1溶劑的選擇溶劑首選乙腈，其次是pH7.5的磷酸鹽緩沖液。二甲基亞砜可能導(dǎo)致肽二聚化，應(yīng)避免使用。5.3.2受試物溶液的配制進(jìn)行試驗(yàn)前，應(yīng)評(píng)估受試物的溶解度。溶解性可用肉眼鑒別，應(yīng)形成澄清透明的溶液。一般受試物最大配制濃度為20mM（應(yīng)完全溶解），對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系終濃度為5mM。試驗(yàn)時(shí)用溶劑連續(xù)稀釋以獲得20、10、5、2.5和1.25mM系列濃度的受試物溶液。20mM的受試物溶液應(yīng)于試驗(yàn)當(dāng)日配制，如提前配制，應(yīng)驗(yàn)證其穩(wěn)定性。通常配制量為5mL，受試物（陽(yáng)性對(duì)照）理論稱(chēng)取量為分子量×10mg（以純物質(zhì)計(jì)）。kDPRA在技術(shù)上適用于成分和含量明確的多成分物質(zhì)和混合物的測(cè)試，此時(shí)，可以根據(jù)不同組分（不包括水）的占比和分子量計(jì)算受試物總的純度和單一的表觀分子量，用于計(jì)算制備20mM溶液的取樣量。5.3.3陽(yáng)性對(duì)照溶液的配制按受試物溶液的配制方法，用乙腈溶解陽(yáng)性對(duì)照物制成20mM濃度的溶液，并稀釋得到20、10、5、2.5和1.25mM系列濃度的溶液。5.4多肽貯備液的配制稱(chēng)取適量半胱氨酸多肽，用pH7.5的磷酸鹽緩沖液配制成0.667mM（0.501mg/mL）的溶液。孵育前新鮮配制，配制時(shí)使用渦旋儀震蕩溶解，必要時(shí)可用超聲溶解，應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，防止多肽降解。pH7.5磷酸鹽緩沖液：取0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液18mL加0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液82mL混合，測(cè)定pH值，應(yīng)在7.50±0.05之間。若偏酸性，加入0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。若偏堿性，加入0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，4℃保存，可在4周內(nèi)使用。5.5單溴二胺溶液的配制稱(chēng)取8.1mg單溴二胺置于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制成3mM單溴二胺溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。6試驗(yàn)步驟6.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)置受試物組（終濃度為0.31mM、0.63mM、1.25mM、2.5mM、5mM）、陽(yáng)性對(duì)照組（positivecontrol,PC）、受試物對(duì)照組（testchemicalcontrol,SC）、溶劑對(duì)照組（vehiclecontrol,VC）和空白對(duì)照組（blankcontrol,BC），其中受試物組每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，VC組、BC組12個(gè)重復(fù)，PC和SC每個(gè)濃度一個(gè)孔。以3個(gè)受試物（A、B、C）為例加樣示例參見(jiàn)圖1。123456789101112AVC組（溶劑+0.5mM多肽）BBC組（溶劑）C0.31mM受試物A+0.5mM多肽0.31mM受試物B+0.5mM多肽0.31mM受試物C+0.5mM多肽0.31mM受試物A+緩沖液0.31mM受試物B+緩沖液0.31mM受試物C+緩沖液D0.63mM受試物A+0.5mM多肽0.63mM受試物B+0.5mM多肽0.63mM受試物C+0.5mM多肽0.63mM受試物A+緩沖液0.63mM受試物B+緩沖液0.63mM受試物C+緩沖液E1.25mM受試物A+0.5mM多肽1.25mM受試物B+0.5mM多肽1.25mM受試物C+0.5mM多肽1.25mM受試物A+緩沖液1.25mM受試物B+緩沖液1.25mM受試物C+緩沖液F2.5mM受試物A+0.5mM多肽2.5mM受試物B+0.5mM多肽2.5mM受試物C+0.5mM多肽2.5mM受試物A+緩沖液2.5mM受試物B+緩沖液2.5mM受試物C+緩沖液G5mM受試物A+0.5mM多肽5mM受試物B+0.5mM多肽5mM受試物C+0.5mM多肽5mM受試物A+緩沖液5mM受試物B+緩沖液5mM受試物C+緩沖液H0.31mMPC+0.5mM多肽0.63mMPC+0.5mM多肽1.25mMPC+0.5mM多肽2.5mMPC+0.5mM多肽5mMPC+0.5mM多肽1.25mMPC+緩沖液2.5mMPC+緩沖液5mMPC+緩沖液10mMPC+緩沖液20mMPC+緩沖液圖1kDPRA反應(yīng)板加樣示例6.2操作步驟每個(gè)反應(yīng)時(shí)間分別準(zhǔn)備應(yīng)用板（受試物溶液稀釋板）和反應(yīng)板。應(yīng)先準(zhǔn)備反應(yīng)板，隨后立即準(zhǔn)備含有受試物稀釋液的應(yīng)用板，并將各組受試物溶液立即加入到反應(yīng)板中。6.2.1反應(yīng)板的準(zhǔn)備使用黑色96孔板，參照?qǐng)D1準(zhǔn)備各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)板。分別在A1~A12、C1-H1~C5-H5、C6~G6、C7-G7~C9-G9孔中加入120μL0.667mM多肽溶液，在B1~B12、C10-G10~C12-G12、H8~H12孔中加入120μLpH7.5的磷酸鹽緩沖液。6.2.2應(yīng)用板的準(zhǔn)備準(zhǔn)備2mL深孔板，參照?qǐng)D2準(zhǔn)備各時(shí)間點(diǎn)的應(yīng)用板。分別在A行、B行、C行~F行中每孔分別加入300μL溶劑，將600μL20mM受試物儲(chǔ)存液加入G行。使用多通道移液器從G行吸取300μL，加入F行，隨后按同樣方法依次稀釋至C行。在H1~H4每孔中每孔分別加入600μL溶劑，將1200μL20mM陽(yáng)性對(duì)照物儲(chǔ)存液加入H5孔。使用移液器從H5孔吸取600μL，加入H4行，按同樣方法依次稀釋至H1。從H1~H5中吸取300μL溶液轉(zhuǎn)移到H8~H12孔。配制完成后及時(shí)用封板膜密封待用。123456789101112A溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑B溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑C1.25mM受試物A1.25mM受試物A1.25mM受試物A1.25mM受試物B1.25mM受試物B1.25mM受試物B1.25mM受試物C1.25mM受試物C1.25mM受試物C1.25mM受試物A1.25mM受試物B1.25mM受試物CD2.5mM受試物A2.5mM受試物A2.5mM受試物A2.5mM受試物B2.5mM受試物B2.5mM受試物B2.5mM受試物C2.5mM受試物C2.5mM受試物C2.5mM受試物A2.5mM受試物B2.5mM受試物CE5mM受試物A5mM受試物A5mM受試物A5mM受試物B5mM受試物B5mM受試物B5mM受試物C5mM受試物C5mM受試物C5mM受試物A5mM受試物B5mM受試物CF10mM受試物A10mM受試物A10mM受試物A10mM受試物B10mM受試物B10mM受試物B10mM受試物C10mM受試物C10mM受試物C10mM受試物A10mM受試物B10mM受試物CG20mM受試物A20mM受試物A20mM受試物A20mM受試物B20mM受試物B20mM受試物B20mM受試物C20mM受試物C20mM受試物C20mM受試物A20mM受試物B20mM受試物CH1.25mMPC2.5mMPC5mMPC10mMPC20mMPC1.25mMPC2.5mMPC5mMPC10mMPC20mMPC圖2應(yīng)用板加樣示例6.3孵育使用多通道移液器從應(yīng)用板中吸取40μL配制好的溶液加入反應(yīng)板對(duì)應(yīng)孔中，用封板膜將反應(yīng)板密封，200rpm/min震搖5min后，25℃分別孵育10min±30s、30min±3min、90min±5min、150min±10min、210min±10min、1440min±15min。6.4測(cè)定孵育結(jié)束后，撕下封板膜，每孔加入新鮮配制的3mM單溴二胺溶液40μL。200~300rpm/min震搖5min后，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)480nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。7數(shù)據(jù)處理7.1熒光值計(jì)算和校正計(jì)算BC組、VC組的平均熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)差，VC孔減去BC組的平均熒光強(qiáng)度值，各濃度受試物和陽(yáng)性對(duì)照孔減去各自的對(duì)照組的熒光強(qiáng)度值。計(jì)算每個(gè)測(cè)試濃度三個(gè)重復(fù)孔的平均熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與VC組（12個(gè)重復(fù)）的平均多肽濃度是否有顯著性差異。7.2多肽消耗率計(jì)算按以下公式計(jì)算多肽消除率：多肽消耗率（%）=[1-]7.3反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)計(jì)算如給定時(shí)間的最高測(cè)試濃度（受試物終濃度為5mM）符合半胱氨酸多肽結(jié)合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，即多肽消除率≥13.89%，且與VC組差異有顯著性，對(duì)該暴露時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步計(jì)算反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。如不符合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，則受試物為非反應(yīng)性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以未消耗肽占比（%）的自然對(duì)數(shù)，即ln（100-dp）為縱坐標(biāo)，受試物濃度為橫坐標(biāo)繪制反應(yīng)曲線，若兩者呈線性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r＞0.90），則得到的負(fù)斜率的絕對(duì)值即為準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)kobserved（mM-1），按照下式計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)kt（M-1s-1）：kt=kobserved·注：t為孵育時(shí)間，以min表示。計(jì)算所有滿足r＞0.90的孵育時(shí)間的lgkt，取其中最大值為lgkmax。8試驗(yàn)成立條件陽(yáng)性對(duì)照組90min時(shí)間點(diǎn)lgk值應(yīng)在-1.75M-1s-1~-1.40M-1s-1范圍內(nèi)，若90min時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有得到lgk值，150min時(shí)間點(diǎn)lgk應(yīng)在-1.90M-1s-1~-1.45M-1s-1范圍內(nèi)。至少有5個(gè)時(shí)間點(diǎn)溶劑對(duì)照組變異系數(shù)（CoefficientofVariation，CV）＜12.5%。9結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按表1對(duì)受試物進(jìn)行致敏性分級(jí)。表1kDPRA結(jié)果判斷試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)結(jié)果lgkmax≥-2.0極強(qiáng)或強(qiáng)致敏劑非反應(yīng)性或lgkmax＜-2.0非致敏劑或中、弱致敏劑10注意事項(xiàng)10.1受試物溶劑為磷酸鹽緩沖液如果受試物溶劑為磷酸鹽緩沖液，則半胱氨酸多肽貯備液配制濃度為1mM（0.752mg/mL），同時(shí)反應(yīng)板制備時(shí)半胱氨酸多肽貯備液（或磷酸鹽緩沖液）每孔加樣體積減少到80μL，然后再加入乙腈或磷酸鹽緩沖液40μL補(bǔ)至120μL，使所有孔中乙腈總體積仍為40μL。10.2非線性反應(yīng)出現(xiàn)非線性反應(yīng)時(shí)無(wú)法通過(guò)斜率法求得速率常數(shù)。速率常數(shù)可以根據(jù)多肽消除率個(gè)體值按以下公式計(jì)算：k=注：dp為多肽消除率（%），E為受試物的濃度，t是孵育時(shí)間。根據(jù)該公式，計(jì)算多肽消耗率高于13.89%的閾值的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)t和每個(gè)濃度E下的速率常數(shù)。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同濃度多肽消耗率求平均值，然后得到lgkmax值。在發(fā)生明顯多肽結(jié)合的情況下，很少會(huì)出現(xiàn)非線性反應(yīng)。出現(xiàn)非線性反應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以檢查這種非線性反應(yīng)是受試物固有的，還是試驗(yàn)誤差所致。如果非線性結(jié)果可重復(fù)，則判定受試物存在固有的非線性反應(yīng)，可采用上述公式基于個(gè)體值的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行判斷。若僅在早期時(shí)間點(diǎn)觀察到顯著的肽消耗，但在隨后的時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有觀察到，也可以將早期時(shí)間點(diǎn)的lgkt作為結(jié)果進(jìn)行致敏性分級(jí)判定。10.3低溶解度受試物對(duì)于最大溶解濃度低于20mM的受試物，可在較低濃度下進(jìn)行試驗(yàn)，如出現(xiàn)lgkmax≥-2.0的結(jié)果，受試物可以判斷為GHS1A亞類(lèi)皮膚致敏物，但對(duì)于非致敏性或lgkmax＜-2.0的結(jié)果則不能得出明確結(jié)論。此外