丙型肝炎實(shí)驗(yàn)診斷研究進(jìn)展

丙型肝炎實(shí)驗(yàn)診斷研究進(jìn)展

山東省臨床檢驗(yàn)中心

盧志明1、有包膜,屬黃病毒科，丙型肝炎屬。2、單股正鏈RNA(9.6kb)3、T?:

2.7小時(shí)4、每日復(fù)制量：10兆(1012)

病毒顆粒PurcellRH.NIHConsensusConferenceonHepatitisC.1997.NeumannAUetal.Science.1998;282:103-107.RosenbergS.JMolBiol.2001;313:451-464.LauerGM,WalkerBD.NEnglJMed.2001;345:41-52.丙型肝炎病毒

從非甲非乙型肝炎到丙型肝炎:1968-1974年間,HAV、HBV診斷方法相繼建立,人們發(fā)現(xiàn)還有一種引起輸血后肝炎的致病因子.1974年紐約的Pince對(duì)204例術(shù)后病人隨訪,6個(gè)月51人(25%)發(fā)生了輸血后肝炎,僅12人與HBV有關(guān).CMV顯然不是輸血后肝炎的原因.1989年9月在東京會(huì)議上命名此種病毒為丙型肝炎病毒(HCV),由此引發(fā)的肝炎稱之為丙型肝炎(HC).

HCV的病毒命名HCV為單股正鏈RNA病毒5`NC區(qū)、3`NC區(qū)為非編碼區(qū)5`NC與3`NC間分結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：C區(qū)、E1、E2；非結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：NS1~55`NC區(qū)最保守，C區(qū)較保守，E2／NS1有高變區(qū)（HVR1）HCV基因組結(jié)構(gòu)表HCV表達(dá)蛋白的特性和功能基因氨基酸數(shù)目抗原功能CE1E2NS2NS3NS4aNS4bNS5aNS5b19119232731663154261448591C22-3Gp33Gp70G33cC100NS5核殼蛋白,高度保守糖膜蛋白,在不同基因中高度變異糖膜蛋白,在不同基因中高度變異金屬蛋白酶蛋白酶和螺旋酶不清楚不清楚復(fù)制酶RNA依賴的RNA聚合酶

全球丙肝的流行情況

1、WHO的資料表明,全世界已有約1.7億丙型肝炎病毒感染者。2、急性HCV感染者中8O-90％可發(fā)展為慢性肝炎,其中約20-30％會(huì)緩慢進(jìn)展為肝硬化。1-5％發(fā)展為肝癌。3、HCV主要經(jīng)血液和血液制品傳播。至今還沒有預(yù)防丙型肝炎的疫苗問世,治療效果不是十分理想。因此,建立一種針對(duì)HCV的具有高靈敏度、特異性和穩(wěn)定性的檢測(cè)方法，對(duì)于防止HCV傳播、HCV感染的早期診斷和治療具有重要意義。我國(guó)丙型肝炎流行情況一般人群抗-HCV流行率:3.2%估計(jì)HCV感染人數(shù):3800萬(全國(guó)病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查

1992~1995)目前經(jīng)過血源的管理，丙肝發(fā)病率應(yīng)當(dāng)有所下降，但有大量病人未被發(fā)現(xiàn)和治療>3%(14省)

2～3%(11省)<2%(6省)我國(guó)各省市自治區(qū)HCV抗體流行率新疆西藏四川貴州海南廣東廣西云南河南江蘇安徽湖北臺(tái)灣福建江西湖南

寧夏山西陜西

遼寧上海天津黑龍江山東青海甘肅北京河北浙江吉林內(nèi)蒙古重慶(全國(guó)病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查

1992~1995)我國(guó)HCV基因型調(diào)查1、HCV1b型是主要的基因型，其檢出率達(dá)83.17％。2、HCV2型檢出率低，占6.86％；其余為1b、2、4b型的混合型。3、HCV1b檢出率在<30歲、30～49歲、>50歲組分別為77.77％、83.92％、90.90％。4、HCV1b在女性感染的比率較高（93.61％），男性為75％，差異有極顯著的統(tǒng)計(jì)意義(p<0.01)。5、HCV1b型在感染時(shí)間>10年和<10年病人中的檢出率分別為100％和80.43％（p<0.01）。HCV感染：中國(guó)HCV基因型的地理分布HCV基因型在中國(guó)的分布以1b型為主，2a型為輔助JiamusiJiamusiShenyangShenyangBeijingBeijingHamiHamiLanzhouLanzhouChengduChengduNanningNanningNanjingNanjing佳木斯佳木斯沈陽沈陽北京北京哈密哈密蘭州蘭州成都成都南京南京南寧南寧II/1bII/1bIII/2aIII/2aII/IIIII/III66aa

WangY,etal.JMedViral,1993,40:254-260莊輝，等.中華流行病學(xué)雜志,2001,22:99-101●長(zhǎng)沙20%痊愈HCV感染的自然史80%持續(xù)感染30%穩(wěn)定，慢性，無進(jìn)展AdaptedfromAlterHF,SeeffLB.SeminLiver

Dis.2000;20:17-35肝臟疾病終末期，肝細(xì)胞癌，肝臟移植，死亡30%呈嚴(yán)重進(jìn)展100位HCV急性感染40%有不同程度進(jìn)展丙型肝炎病毒(HCV)感染危害性不容忽視全球性流行

—— 3%(1.7億)慢性化的危險(xiǎn)性

—— 60%–85%臨床診斷病例——<30%肝硬化的危險(xiǎn)性

—— 在感染后20年內(nèi)達(dá)10% 在感染后30年內(nèi)達(dá)20%肝硬化患者中肝細(xì)胞癌

—— 1%–4%/年(美國(guó))

的發(fā)生率~7%(日本、臺(tái)灣)失代償肝硬化10年存活率——25％肝硬化相關(guān)性病死率

—— 1%–5%/年WHO.HepatitisC.Factsheetno.164.EmmetB.Keeffe,MD,MedscapeGastroenterologyeJournal,2002,4(2)NationalInstituteofHealthConsensusDevelopmentConferenceStatement:ManagementofHepatitisC:2002-June10-12,2002ConsensusstatementsonthepreventionandmanagementofhepatitisBandCintheAsia-pacificregionHCV的感染人數(shù)=臨床病例？發(fā)病隱匿基層臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)不足丙肝檢測(cè)沒有納入常規(guī)查體項(xiàng)目確診比較難，費(fèi)用高抗體的窗口期，RNA的假陰性**

——臨床診斷病例少NationalInstituteofHealthConsensusDevelopmentConferenceStatement:ManagementofHepatitisC:2002-June10-12,2002美國(guó)：在2015年以前，臨床診斷HCV的成人病例數(shù)增加4倍中國(guó)：挑戰(zhàn)？！高慢性化率高感染率、低診斷率無有效疫苗預(yù)防認(rèn)識(shí)不足挑戰(zhàn)!!

問題與挑戰(zhàn)我們?nèi)绾螒?yīng)對(duì)挑戰(zhàn)？1、制定中國(guó)丙肝防治指南：規(guī)范丙肝的篩查，診斷和治療。2、加強(qiáng)丙肝疾病和診療對(duì)基層醫(yī)生的教育。3、重視臨床一線對(duì)丙肝的篩查。4、通過各種途徑提高公眾對(duì)丙肝的防范意識(shí)：如媒體等。近年來丙肝研究進(jìn)展丙肝分型、病毒復(fù)制、病毒變異等慢性化機(jī)制、脂肪變性、癌變機(jī)理等抗病毒治療：I型應(yīng)答率40%；II型應(yīng)答率80%特異性靶向抗病毒治療（2期臨床）實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展多抗原包被的抗體檢測(cè)（第3代抗-HCV）HCV-Ag的檢測(cè)（第4代）抗原-抗體聯(lián)合檢測(cè)（篩查）HCV的基因分型HCV-RNA的檢測(cè)

——總之，實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展？

診斷、監(jiān)測(cè)方法HCV血清學(xué)試驗(yàn)EIA檢測(cè)抗HCVHCV-RNA定性試驗(yàn)PCR、TMAHCV-RNA定量試驗(yàn)PCR、bDNAALT肝纖維化非損傷試驗(yàn)肝活檢基因分型

實(shí)驗(yàn)室診斷方法NationalInstituteofHealthConsensusDevelopmentConferenceStatement:ManagementofHepatitisC:2002-June10-12,2002HCV血清學(xué)試驗(yàn)EIA檢測(cè)HCV抗原常用的檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-HCV抗體檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-HCV核心抗原檢測(cè)免疫學(xué)方法-免疫印跡法（RIBA）免疫學(xué)方法-血清學(xué)分型分子生物學(xué)方法-HCV-PCR定量、HCV-PCR定性分子生物學(xué)基因分型方法-型特異PCR分型法、型特異探針雜交法、限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFIJP)、核酸序列分析法、酶切分型法、基因芯片等感染丙肝病毒后各指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間表

Anti-HCVWindow=70days(3rdGen)

=82days(2ndGen)100806040200AnalyteLevelTimeHCVRNAWindow=approximately11~13daysAnti-HCVHCV-RNAHCVAgWindow=12~14daysHCV-Ag清學(xué)分型感染丙肝病毒后各指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間表

Anti-HCVWindow=70days(3rdGen)

=82days(2ndGen)100806040200AnalyteLevelTimeHCVRNAWindow=approximately11~13daysAnti-HCVHCV-RNAHCVAgWindow=12~14daysHCV-Ag清學(xué)分型HCV抗體檢測(cè)應(yīng)用的不足目前國(guó)內(nèi)主要應(yīng)用抗HCV/EIA檢測(cè)抗體，經(jīng)抗體篩選后，臨床上仍有少量的輸血后丙肝的發(fā)生。主要原因窗口期

丙肝抗體假陰性問題1.窗口期2.靜默感染

(immunosilentinfection)3.試劑質(zhì)量4.其它

HCV抗體檢測(cè)應(yīng)用的不足1、不能用于丙型肝炎的早期診斷。2、臨床上不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。3、抗病毒治療不一定造成抗HCV陰轉(zhuǎn)，不能用于抗病毒療效的檢測(cè)。血清HCV-RNA的檢測(cè)

血清HCV-RNA的定性檢測(cè)：容易產(chǎn)生假陽性或假陰性（PCR產(chǎn)物易產(chǎn)生污染）血清HCV-RNA的定量檢測(cè)：缺點(diǎn)：RNA降解容易出現(xiàn)假陰性優(yōu)點(diǎn)：可用于抗病毒治療的選擇與療效監(jiān)測(cè)免疫學(xué)方法-免疫印跡法

重組免疫印跡法(Recornbinant

immunobIot，

RIBA)RIBA是FDA批準(zhǔn)的抗HCV補(bǔ)充試驗(yàn)．主要是解決ELISA試驗(yàn)中的假陽性問題。目前廣泛使用的RIBA一3非特異性反應(yīng)明顯減少，敏感度顯著提高(99．5）。

缺點(diǎn)是RIBA在操作上較ELISA困難，費(fèi)時(shí)、成本高，因此限制了這項(xiàng)技術(shù)在臨床上的普遍使用。目前檢測(cè)方法抗-HCVandHCV-RNA的檢測(cè)

——不能滿足臨床早期、準(zhǔn)確、可靠的要求。RIBA實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、費(fèi)用較高、推廣難丙肝抗原檢測(cè)1、丙型肝炎早期感染診斷指標(biāo)2、丙型肝炎確診指標(biāo)3、丙型肝炎治療評(píng)價(jià)指標(biāo)4、丙型肝炎篩查指標(biāo)HCV核心抗原的檢測(cè)抗-HCV“游離”抗原時(shí)間HCV

感染過程早期檢測(cè)“篩查”“總”抗原(抗體結(jié)合)“總”抗原診斷用12-14天年1pg/ml總HCV核心抗原=8000IU/mlHCVRNA日70-80天感染丙肝病毒后各指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間表抗-HCV“游離”抗原早期檢測(cè)“篩查”“總”抗原■HCVRNA11~13days

■HCVAg12~14

days■

Anti-HCV=70days(3rdGen)=82days(2ndGen)1pg/ml總HCV核心抗原=8000IU/mlHCVRNAHCVRNA1102030405060809010011012013014015070天時(shí)間靈敏度0102030405060檢驗(yàn)原理

通過對(duì)血清或血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理，解離HCV抗原/抗體復(fù)合物并釋放出所有核心抗原，經(jīng)固相包被特異性抗體捕獲后，再與酶標(biāo)記抗體形成雙抗體夾心復(fù)合物，最后加入酶底物顯色，以產(chǎn)品規(guī)定的可見光波長(zhǎng)臨界OD值判斷HCV抗原檢測(cè)結(jié)果。

HCV抗原ELISA基本原理

HCV抗體

抗原抗HCV抗體-HRPHRP抗HCV體

酶聯(lián)板樣本處理

不同亞型丙型肝炎病毒核心抗原的序列分析

1020 30 40 5060

HCV1 MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQ

DVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGHCV1b MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGHCV2aMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGHCV2b MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGHCV3 MSTLPKPQRKTKRNTIRRPQDVKFPGGGQIVGGVYVLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRG

70 80 90 100110 120HCV1 RRQPIPKARQPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSP

RGSRPSWGPTDPRRRSRNLG

HCV1b RRQPIPKARQPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRHRSRNLGHCV2a RRQPIPKDRQSTGKSWGKPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPTWGPTDPRHRSRNLGHCV2b RRQPIPKDRQSTGKSWGKPGYPWPLYGNEGLGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNVGHCV3 RRQPIPKARQSEGRSWAQPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLG

130140150160HCV1

KVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGARRALAHGVRVLEDHCV1bKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGARRALAHGVRVLEDHCV2aKVIDTLTCGFADLMGYIPVVGAPVGGARRALAHGVRVLEDHCV2bKVIDTLTCGFADLMGYIPVVMAPLGGARRALAHGVRVLEDHCV3KVIDTLTCGFADLMGYIPLVMAPVGGARRALAHGVRALED

四株單抗亞型檢定1號(hào)(CAb-1)IgG2a2號(hào)(CAb-2)IgG2a3號(hào)(EAb-1)IgG2b4號(hào)(EAb-2)IgG1HCV-Ag和HCV-RNA檢測(cè)的比較

HCVcAgHCVRNA樣本儲(chǔ)存的條件要求普通特殊樣本的前處理試劑不需要需要特殊儀器要求無有實(shí)驗(yàn)人員的訓(xùn)練普通專業(yè)實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低高根據(jù)我國(guó)目前的狀況,HCVcAg檢測(cè)更符合我國(guó)的國(guó)情,可以為血液安全,臨床診斷提供廉價(jià),切實(shí)可行的檢測(cè)方法.丙肝抗體檢測(cè)“窗口期”補(bǔ)充方案1.檢測(cè)丙肝抗原2.檢測(cè)丙肝病毒RNA3.聯(lián)合檢測(cè)：HCVAg+HCVRNA+HCVAb

HCV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程HCV-AgHCV-Ab陰性報(bào)告RR陽性S/CO比值<3.8ECiS/CO<8

HCV-Ab

RIBAHCVRNANAT陰性其他結(jié)果評(píng)價(jià)(如NAT、ALT)陰性陽性可疑陽性RR陽性EIAS/CO>3.8ECiS/CO>

8或報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告丙肝確診后的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HCV基因分型——選擇抗病毒治療防案、療效評(píng)價(jià)、確定療程，預(yù)后判斷HCV-RNA定量的檢測(cè)——評(píng)價(jià)抗病毒治療的療效丙肝抗原定量檢測(cè)——即將上市，評(píng)