T-GXDSL 031-2024 藥用植物毛狀根高通量培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

39.020T/GXDSLTechnicalRegulationsforHigh-throughputCultureofHairyRootsofMedicinal廣西電子商務(wù)企業(yè)聯(lián)合會(huì)發(fā)布IT/GXDSL031—2024 一、范圍 1二、規(guī)范性引用文件 1三、術(shù)語和定義 1四、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與環(huán)境 11.設(shè)施布局 22.環(huán)境參數(shù) 23.人員資質(zhì)與培訓(xùn) 2五、材料與試劑 21.藥用植物材料 32.發(fā)根農(nóng)桿菌菌株與培養(yǎng)基 3六、培養(yǎng)技術(shù)流程 31.發(fā)根農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng) 32.毛狀根的誘導(dǎo)與篩選 33.毛狀根的高通量培養(yǎng) 4七、質(zhì)量控制 41.培養(yǎng)物的無菌檢測(cè) 42.毛狀根的生長(zhǎng)指標(biāo)檢測(cè) 43.次生代謝產(chǎn)物的含量測(cè)定 54.數(shù)據(jù)管理與保存 55.培養(yǎng)物的檢測(cè) 56.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的監(jiān)測(cè) 57.次生代謝產(chǎn)物的檢測(cè) 68.微生物污染檢測(cè) 6八、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定 6九、附則 7T/GXDSL031—2024本文件依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由廣西產(chǎn)學(xué)研科學(xué)研究院提出。本文件由廣西電子商務(wù)企業(yè)聯(lián)合會(huì)歸口。本文件起草單位：廣西研科院高新技術(shù)有限公司，廣西產(chǎn)學(xué)研科學(xué)研究院，廣西研科院傳媒有限公司，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，容縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西容縣農(nóng)樂農(nóng)業(yè)科技有限公司，容縣大藤樹餐飲有限公司，廣西澤靈科技有限公司.本文件主要起草人：莊文斌，周伯韜,甘漢才,周廣,梅華,賴桂華，莫朝森，黃麗萍，張婷梁標(biāo)，劉福平，曾少蘭，李健，林松，梁勇，黃云，賴業(yè)明，黎雄。本文件為首次發(fā)布。1T/GXDSL031—2024藥用植物毛狀根高通量培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程一、范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了藥用植物毛狀根高通量培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與環(huán)境要求、人員資質(zhì)與培訓(xùn)、材料與試劑、培養(yǎng)技術(shù)流程、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)管理與保存等方面的技術(shù)規(guī)范。適用于各類藥用植物毛狀根的高通量培養(yǎng)研究與生產(chǎn)實(shí)踐。二、規(guī)范性引用文件?GB50457-2019《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》?GB/T6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》?NY/T1281-2007《花卉植物組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程》三、術(shù)語和定義?藥用植物毛狀根：由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將其Ri質(zhì)粒上的T-DNA整合到藥用植物細(xì)胞基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的特殊不定根，具有生長(zhǎng)迅速、遺傳穩(wěn)定、次生代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng)等特點(diǎn)。?高通量培養(yǎng)：利用自動(dòng)化、微型化、集成化的培養(yǎng)設(shè)備與技術(shù)體系，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量藥用植物毛狀根培養(yǎng)物進(jìn)行同步、高效培養(yǎng)與監(jiān)測(cè)的方法。四、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與環(huán)境2T/GXDSL031—20241.設(shè)施布局?實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃分接種區(qū)、培養(yǎng)區(qū)、檢測(cè)區(qū)等功能區(qū)域，各區(qū)域之間應(yīng)有效隔離，避免交叉污染。接種區(qū)應(yīng)配備超凈工作臺(tái)、紫外燈等滅菌設(shè)備，潔凈度等級(jí)應(yīng)達(dá)到100級(jí)。?培養(yǎng)區(qū)應(yīng)具備溫度、濕度、光照、氣體濃度等環(huán)境參數(shù)自動(dòng)調(diào)控功能，安裝通風(fēng)換氣系統(tǒng)與空氣凈化裝置，保持空氣清新，減少微生物與塵埃粒子污染。2.環(huán)境參數(shù)?溫度控制在22°C-28°C，精度為±1°C；相對(duì)濕度維持在40%-60%，精度為±5%。光照強(qiáng)度根據(jù)藥用植物種類設(shè)定在1000lx-5000lx之間，光照周期為12h-16h光照/8h-12h黑暗。?培養(yǎng)室內(nèi)二氧化碳濃度控制在300ppm-800ppm，氧氣濃度不低于20%，通過氣體傳感器與通風(fēng)設(shè)備實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與調(diào)節(jié)。3.人員資質(zhì)與培訓(xùn)?從事藥用植物毛狀根高通量培養(yǎng)的技術(shù)人員應(yīng)具有生物學(xué)、藥學(xué)、生物技術(shù)等相關(guān)專業(yè)本科及以上學(xué)歷，或具有同等專業(yè)技術(shù)水平與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。?定期組織人員參加專業(yè)培訓(xùn)，內(nèi)容包括無菌操作技術(shù)、植物組織培養(yǎng)原理與方法、儀器設(shè)備使用與維護(hù)、質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)分析等，培訓(xùn)時(shí)間不少于40學(xué)時(shí)/年。五、材料與試劑3T/GXDSL031—20241.藥用植物材料?選擇健康、無病蟲害的藥用植物種子、幼苗、葉片、莖段等作為外植體材料。采集后應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，如清洗、消毒、表面滅菌等操作，消毒試劑可選用70%-75%酒精、0.1%-0.2%升汞溶液等，消毒時(shí)間根據(jù)材料類型與污染程度確定，一般為30s-10min。2.發(fā)根農(nóng)桿菌菌株與培養(yǎng)基?選用適宜的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株，如A4、R1601等，購(gòu)自專業(yè)菌種保藏機(jī)構(gòu)或經(jīng)鑒定的實(shí)驗(yàn)室自行保存菌株。?培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)藥用植物種類與培養(yǎng)目的進(jìn)行優(yōu)化配置，常用的基本培養(yǎng)基有MS、B5、White等，添加適量的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、氨基酸、維生素、蔗糖、瓊脂等成分，pH值調(diào)節(jié)至5.5-6.5。六、培養(yǎng)技術(shù)流程1.發(fā)根農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)?從甘油保存菌種中取少量發(fā)根農(nóng)桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，在28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h-48h，待菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28°C、150r/min-200r/min條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌液濃度達(dá)到10^8-10^9cfu/mL。2.毛狀根的誘導(dǎo)與篩選?將預(yù)處理后的藥用植物外植體與活化后的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液共培養(yǎng)，共培養(yǎng)時(shí)間為10min-60min，共培養(yǎng)溫度為22°C-25°C。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)基添加4T/GXDSL031—2024適量抗生素以抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)2-4周后，觀察外植體上毛狀根的誘導(dǎo)情況，篩選出生長(zhǎng)迅速、形態(tài)正常的毛狀根。3.毛狀根的高通量培養(yǎng)?采用生物反應(yīng)器進(jìn)行毛狀根高通量培養(yǎng)，生物反應(yīng)器類型可選擇氣升式、攪拌式、鼓泡式等。根據(jù)生物反應(yīng)器容積與毛狀根生長(zhǎng)特性確定接種量，一般為10%-30%（v/v）。?培養(yǎng)過程中，通過在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溫度、pH值、溶解氧、電導(dǎo)率等參數(shù)，并根據(jù)設(shè)定閾值自動(dòng)調(diào)控。定期取樣檢測(cè)毛狀根的生長(zhǎng)狀況與次生代謝產(chǎn)物含量，培養(yǎng)周期根據(jù)藥用植物種類與培養(yǎng)目的確定，一般為2-8周。七、質(zhì)量控制1.培養(yǎng)物的無菌檢測(cè)?定期取少量毛狀根培養(yǎng)物，采用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種于LB固體培養(yǎng)基與PDA固體培養(yǎng)基上，分別在28°C與25°C培養(yǎng)2-3天，觀察有無細(xì)菌與真菌污染菌落生長(zhǎng)，無菌檢測(cè)頻率為每周1-2次。2.毛狀根的生長(zhǎng)指標(biāo)檢測(cè)?每隔3-5天測(cè)量毛狀根的鮮重、干重、根長(zhǎng)、分支數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)，計(jì)算生長(zhǎng)速率與增殖倍數(shù)。生長(zhǎng)速率公式：GR=(W2-W1)/(t2-t1)，其中GR為生長(zhǎng)速率，W1、W2分別為兩次測(cè)量的鮮重或干重，t1、t2為對(duì)應(yīng)的時(shí)間；增殖倍數(shù)公式：PF=N2/N1，其中PF為增殖倍數(shù)，N1、N2分別為初始與最終的毛狀根數(shù)量。5T/GXDSL031—20243.次生代謝產(chǎn)物的含量測(cè)定?采用高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、質(zhì)譜法（MS）等分析技術(shù)測(cè)定毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中次生代謝產(chǎn)物的濃度，含量測(cè)定頻率為每培養(yǎng)周期2-3次。4.數(shù)據(jù)管理與保存?建立完善的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，實(shí)時(shí)記錄培養(yǎng)過程中的環(huán)境參數(shù)、操作記錄、檢測(cè)數(shù)據(jù)等信息，數(shù)據(jù)記錄應(yīng)準(zhǔn)確、完整、可追溯。?數(shù)據(jù)保存時(shí)間不少于5年，采用電子文檔與紙質(zhì)文檔雙重備份方式，電子文檔存儲(chǔ)在專用服務(wù)器或硬盤中，定期進(jìn)行數(shù)據(jù)備份與更新；紙質(zhì)文檔分類整理歸檔，存放在干燥、通風(fēng)、防蟲的檔案室。5.培養(yǎng)物的檢測(cè)?形態(tài)與生長(zhǎng)狀況檢測(cè)：定期觀察毛狀根的形態(tài)特征，包括根的長(zhǎng)度、直徑、分支數(shù)量、顏色及質(zhì)地等，并記錄生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線，以便及時(shí)掌握毛狀根的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。正常的毛狀根應(yīng)呈現(xiàn)白色或淡黃色，質(zhì)地緊密，分支發(fā)達(dá)。?遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)：運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR、Southern雜交等，定期檢測(cè)毛狀根的遺傳穩(wěn)定性，確保其在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中Ri質(zhì)粒中的T-DNA穩(wěn)定整合于植物基因組中，未發(fā)生丟失、重排或突變等現(xiàn)象，維持穩(wěn)定的次生代謝產(chǎn)物合成能力。6.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的監(jiān)測(cè)6T/GXDSL031—2024?營(yíng)養(yǎng)成分監(jiān)測(cè)：定期檢測(cè)培養(yǎng)基中的大量元素、微量元素、碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)成分的含量，確保其濃度在適宜范圍內(nèi)，為毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物合成提供充足的營(yíng)養(yǎng)支持。?理化性質(zhì)監(jiān)測(cè)：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的pH值、溫度、溶氧濃度等理化參數(shù)，使其嚴(yán)格控制在設(shè)定范圍內(nèi)。如pH值應(yīng)保持在5.5-6.5，溶氧濃度控制在50%-80%飽和度，以保障毛狀根的正常生長(zhǎng)和代謝。7.次生代謝產(chǎn)物的檢測(cè)?含量檢測(cè)：采用高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、質(zhì)譜法（MS）等分析方法，定期檢測(cè)毛狀根及培養(yǎng)液中次生代謝產(chǎn)物的含量，如藥用植物中的生物堿、黃酮類、萜類等活性成分，建立含量變化曲線，為優(yōu)化培養(yǎng)條件提供依據(jù)。?成分分析：對(duì)次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行成分分析，確保所合成的次生代謝產(chǎn)物種類符合預(yù)期，且無異常成分出現(xiàn)。同時(shí)，關(guān)注產(chǎn)物中雜質(zhì)的含量，保證產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。8.微生物污染檢測(cè)?定期抽檢：定期對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行微生物檢測(cè)，包括細(xì)菌、真菌和病毒等的檢測(cè)。采用平板劃線法、稀釋涂布平板法等方法，檢測(cè)培養(yǎng)基和毛狀根表面的微生物菌落數(shù)量，確保無菌生長(zhǎng)。?污染處理：一旦發(fā)現(xiàn)微生物污染，應(yīng)立即采取相應(yīng)的處理措施，如對(duì)污染的培養(yǎng)物進(jìn)行隔離、銷毀，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境和設(shè)備進(jìn)行徹底消毒等，防止污染擴(kuò)散。八、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定?制定質(zhì)量指標(biāo)：根據(jù)藥用植物的種類、用途及相關(guān)法規(guī)要求，制定毛狀根培養(yǎng)物及其次生代謝產(chǎn)物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括外觀、純度、含量、雜質(zhì)限度等指標(biāo)，確保產(chǎn)品質(zhì)量