pcr·電泳·實(shí)驗(yàn)+高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

P84PCR儀器PCR→PCR產(chǎn)物→電泳2、DNA移動(dòng)的方向：向與自身帶電情況相反的電極方向移動(dòng)一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便由負(fù)極向正極泳動(dòng)。1、DNA移動(dòng)的原理3、DNA移動(dòng)進(jìn)度的觀測(cè)：依靠：電泳指示劑【拓展】電泳指示劑還可以：使上樣孔中的樣品可見，確保樣品準(zhǔn)確加入孔內(nèi)。電泳原理：指示劑移動(dòng)速率比DNA更快，當(dāng)指示劑遷移至凝膠邊緣時(shí)，提示應(yīng)及時(shí)停止電泳，避免目標(biāo)分子跑出凝膠。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠瓊脂糖的微結(jié)構(gòu)資料卡片：瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，從瓊脂中提取而來，在電泳緩沖液中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的膠體胨，具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。拓展：瓊脂糖冷卻后形成具有剛性濾孔的膠體胨，凝膠孔徑的大小由瓊脂糖的濃度決定。筆記：瓊脂糖凝膠電泳中影響DNA分子移動(dòng)速率的因素：①凝膠的濃度②DNA分子大小和構(gòu)像③電壓大?。ㄓ绊懩z濾孔孔徑大小）規(guī)律：DNA分子越大，遷移越慢。微量離心管：實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴(kuò)增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0作用：抑制核酸酶活性，保護(hù)DNA微量離心管：實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴(kuò)增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0凝膠載樣緩沖液：含：溴酚藍(lán)是：電泳指示劑作用：抑制核酸酶活性，保護(hù)DNA微量離心管：實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所微量移液器：用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體擴(kuò)增緩沖液：含鎂離子、pH：8.0電泳緩沖液：是Tris-乙酸鹽緩沖液或Tris-硼酸鹽緩沖液含EDTA、pH：8.0凝膠載樣緩沖液：含：溴酚藍(lán)是：電泳指示劑作用：抑制核酸酶活性，保護(hù)DNA核酸染料：的作用：染劑與DNA結(jié)合后能吸收300nm波長(zhǎng)的紫外光，發(fā)出可見熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA分子的含量成正比。與樣品一起添加在加樣孔中配置凝膠糖溶液時(shí)添加在已融化并稍微冷卻后的凝膠中實(shí)驗(yàn)1：PCR等濃度、等量參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部移液離心擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)1：PCR使DNA充分變性，雙鏈打開，以利于引物更好地和模板結(jié)合思考1：預(yù)變性的目的是什么？思考2：為什么最后1次變性時(shí)間延長(zhǎng)？使DNA充分變性，雙鏈打開，以利于引物更好地和模板結(jié)合思考1：預(yù)變性的目的是什么？原理：①TaqDNA聚合酶活性會(huì)隨著循環(huán)次數(shù)增加而下降，導(dǎo)致在后期的PCR循環(huán)中，會(huì)發(fā)生“部分片段可能沒有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脫落了”的情況，形成“半成品DNA”。②與正常DNA產(chǎn)物相比，這種“半成品DNA”在變性時(shí)需要的能量更多。目的：為了讓未延伸完全的DNA雙鏈部分完全解開，重新延伸。思考3：為什么最后1次延伸時(shí)間延長(zhǎng)？確保DNA鏈完整合成梳子配制瓊脂糖溶液制備凝膠實(shí)驗(yàn)2：瓊脂糖凝膠電泳加樣配制瓊脂糖溶液制備凝膠實(shí)驗(yàn)2：瓊脂糖凝膠電泳加樣【筆記】標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）1、是：已知的DNA分子大小的片段，2、作用：在實(shí)驗(yàn)時(shí)和樣本DNA同時(shí)進(jìn)行凝膠電泳，通過對(duì)比兩者的遷移速率，可以大致估計(jì)樣本DNA的大小。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣實(shí)驗(yàn)2：瓊脂糖凝膠電泳電泳、觀察分子量大（長(zhǎng)片段）分子量?。ǘ唐危┖可伲ú涣痢⒓?xì)帶）含量多（很亮、粗帶）注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20°C儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。結(jié)果分析1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段?判斷的依據(jù)是什么?可以通過紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細(xì)來評(píng)價(jià)擴(kuò)增結(jié)果。電泳方向小片段大片段規(guī)律：DNA分子量越大，遷移的越慢（條帶位置遠(yuǎn)離點(diǎn)樣孔）DNA分子量越小，遷移的越快（條帶位置靠近點(diǎn)樣孔）且DNA數(shù)量越多，條帶越寬、越亮。2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶?如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：①漏加了PCR的反應(yīng)成分，②各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，③PCR程序設(shè)置不當(dāng)如果擴(kuò)增擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：①引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合成二聚體②退后溫度過低③DNA聚合酶的質(zhì)量不好若外源基因是單點(diǎn)（單個(gè)）插入植物核基因組（且未破壞內(nèi)源基因），自交后通常表現(xiàn)為孟德爾分離比（如3:1或1:2:1）。但是：大多數(shù)情況下，插入的目的基因數(shù)量、插入的位置都是隨機(jī)的