實驗動物 小鼠細小病毒檢驗方法 征求意見稿

實驗動物小鼠細小病毒檢測方法本文件規(guī)定了小鼠細小病毒（MVM）的檢測方法和試劑等。本文件適用于小鼠細小病毒的檢測，或實驗接種物、實驗動物環(huán)境樣本和動物源性生物制品中小鼠細小病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.42實驗動物細菌學檢測標本采集GB/T14926.50實驗動物酶聯(lián)免疫吸附試驗GB/T14926.51實驗動物免疫酶試驗GB/T14926.52實驗動物免疫熒光試驗GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求3原理酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）/免疫酶試驗（IEA根據(jù)免疫學原理，采用MVM抗原檢測小鼠血清中MVM抗體，兩者形成的抗原抗體復合物可與相應的酶標二抗結合，在酶的催化作用下底物發(fā)生反應，產生有色物質。顏色反應的深淺與待檢血清中所含有的MVM抗體的量成正比。免疫熒光試驗（IFA采用MVM抗原檢測小鼠血清中MVM抗體，兩者形成的抗原抗體復合物可與相應的熒光素標記的二抗結合，在紫外光或藍紫光的照射下，激發(fā)出可見的熒光，在熒光顯微鏡下以熒光的有無和強弱判定結果。實時熒光PCR試驗：提取自樣本的病毒DNA，通過針對MVM的特異性引物和探針，在DNA聚合酶作用下，經過變性、退火和延伸三個步驟的循環(huán)，進行特異性擴增目標DNA片段，根據(jù)檢測結果判定樣品中是否含有MVM核酸。4主要試劑與器材4.1主要試劑4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原MVM接種敏感細胞（如小鼠胚（ME）細胞、3T3細胞等），培養(yǎng)7～10d，病變達+++~++++時收獲。凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細胞碎片，上清液再經超速離心濃縮后制成ELISA抗原。4.1.1.2正常抗原未接種MVM的正常培養(yǎng)細胞（如ME細胞、3T3細胞等）凍融破碎后，經低速離心去除細胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片MVM接種敏感細胞（如大鼠胚（RE）細胞、ME細胞等培養(yǎng)7～10d，病變達++～+++時用胰酶消化分散，PBS洗滌，涂片。室溫干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。4.1.3陽性血清MVM抗原免疫SPF小鼠所獲得的抗血清。4.1.4陰性血清SPF小鼠血清。4.1.5酶結合物辣根過氧化物酶標記羊或兔抗小鼠IgG抗體；或辣根過氧化物酶標記葡萄球菌蛋白A4.1.6熒光結合物異硫氰酸熒光素標記羊或兔抗小鼠IgG抗體4.1.7核酸提取試劑盒。4.1.8探針法熒光PCRMIX預混液。4.1.9qPCR陰性對照不含有MVMDNA的樣本（可以是正常動物組織或正常培養(yǎng)物）4.1.10qPCR陽性對照含有MVM的組織或細胞培養(yǎng)物的樣本4.1.11引物和探針根據(jù)序列（見表1）合成引物和探針，引物和探針加入滅菌去離子水配制成10μmol/L儲備液，-20℃保存。**探針也可選用具有與FAM和BHQ-1熒光基團相同效果的其他合適熒光報告基團和熒光淬滅基團組合。4.2主要器材4.2.137℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴箱4.2.2酶標儀4.2.3普通顯微鏡和熒光顯微鏡4.2.4生物安全柜4.2.5實時熒光PCR儀4.2.6渦旋振蕩器5檢測方法5.1生物安全措施實驗操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關資質的工作人員進行相應操作。5.2實驗室總體技術要求實驗室總體技術要求和檢驗質量控制的基本要求參考GB/T19495.2的規(guī)定。5.3樣本采集及處理檢測步驟5.3.1血清采集參照GB/T14926.424.3血清采樣。5.3.2臟器組織、盲腸內容物或糞便、實驗接種物、實驗動物環(huán)境樣本等的采集參見附錄A。5.4采用ELISA方法（見GB/T14926.50）進行檢測，或使用驗證合格的等效試劑盒檢測。5.5采用IEA方法（見GB/T14926.51）進行檢測，或使用驗證合格的等效試劑盒檢測。5.6采用IFA方法（見GB/T14926.52）進行檢測，或使用驗證合格的等效試劑盒檢測。5.7采用實時熒光PCR方法（見附錄A）進行核酸檢測，或使用驗證合格的等效試劑盒檢測。6結果判定6.1采用ELISA方法參照GB/T14926.50進行結果判定，或按使用的等效試劑盒進行判定。6.2采用IEA方法可參照GB/T14926.51進行結果判定，或按使用的等效試劑盒進行判定。6.3采用IFA方法可參照GB/T14926.52進行結果判定，或按使用的等效試劑盒進行判定。6.4采用實時熒光PCR方法可參照附錄A進行結果判定，或按使用的等效試劑盒進行判定。對于血清學陽性檢測結果，選用同一種方法或另一種方法重試，如仍為陽性則判為陽性。對于實時熒光PCR方法陽性或可疑結果，用同一種方法重試，如仍為陽性或可疑，則判為陽性。7結果報告根據(jù)判定結果，出具報告。（規(guī)范性附錄）小鼠細小病毒實時熒光PCR檢測方法A.1核酸檢測樣本的采集和處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套。A.1.1臟器組織活體小鼠安樂死后剖檢，無菌采集腸系膜淋巴結、腎臟、脾臟、肝臟或腫瘤組織，剪取2-3mm3的待檢樣本于2mL無菌離心管，加入200μL裂解液，使用電動勻漿器或其他勻漿儀器將組織充分破碎勻漿約2min，然后將組織懸液3000r/min離心10min，取上清液轉入另一無菌2mL離心管中，編號備用。A.1.2盲腸內容物或糞便無菌采集小鼠盲腸內容物或糞便于2mL無菌離心管中，加入適量體積的PBS（1-2粒糞便約加入0.4mLPBS）。使用電動勻漿器或其他勻漿儀器充分破碎勻漿約2min，12000r/min離心10min，取上清液轉入另一無菌5mL離心管中，編號備用。A.1.3實驗接種物（如腫瘤細胞、腫瘤組織）吸取新鮮或凍融過的細胞懸液200μL，加入1.5～2倍體積的裂解液混勻，編號備用。其他生物制品與細胞處理相同。腫瘤組織采集和處理參考A.1.1臟器組織。A.1.4實驗動物環(huán)境樣本取適量小鼠飼料和墊料至50mL無菌離心管中，加入足夠體積的滅菌PBS，浸泡成勻漿，充分渦旋混勻，1750r/min離心3min，將1.5mL的上清液轉移至2.0mL無菌離心管中，12000r/min離心10min，取上清液轉入另一無菌2mL離心管中，編號備用。取適量實驗動物飲水直接轉移到無菌5mL離心管中，編號備用。用粘性無菌拭子或無菌棉拭子擦拭實驗動物設施設備出風口初效濾膜表面沉積物、房間中或其他設備重點區(qū)域表面，將拭子從根部折斷，保留拭子棉頭，置于2mL無菌離心管中，加入能沒過拭子的最少體積裂解液浸泡，充分渦旋混勻，12000r/min離心1min，吸取浸泡液至另一2mL無菌離心管，編號備用。A.2樣本的運輸和存放采集或處理的樣本在2～8℃條件下保存應不超過24h，若需長期保存，須放置-80℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。A.3樣本DNA的提取參照核酸提取試劑盒說明書進行陽性對照、陰性對照和樣本DNA的提取。提取后的DNA應盡快進行下一步PCR反應，若暫時不能進行下一步，應于-20℃保存?zhèn)溆?。A.4實時熒光PCR檢測A.4.1實時熒光PCR反應體系和反應參數(shù)反應體系見表2。反應液的配制在冰上操作，每次反應同時設置陽性對照、和陰性對照。反應參數(shù)見表3。13317否15是A.4.2實時熒光PCR結果判定A.4.2.1結果分析和條件設定直接讀取檢測結果，包括擴增曲線和Ct值（Ct值cyclethreshold，即實時熒光PCR反應中每個反應管內的熒光信號到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)），基線和閾值設定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣本擴增曲線的最高點為準。A.4.2.2質控標準空白對照無Ct值，并且無特異性擴增曲線。陰性對照無Ct值，并且無特異性擴增曲線。陽性對照Ct值應≤37，并且有明顯的特異性擴增曲線，則表明反應體系運行正常，否則此次試驗無效，需重新進行實時熒光PCR